[发明专利]一种基于微滴数字PCR技术的EGFR检测方法和应用

权利要求书

1.一种基于微滴数字PCR的血浆EGFR突变检测方法，包括如下步骤：

(1)血浆分离和血浆DNA提取

(2)Master mix混合液制备

(3)微滴生成

(4)封板

(5)热循环

(6)微滴读取

(7)数据分析

所述步骤(1)采用Qiagen DSP DNAMini试剂盒，包括利用真空系统提取DNA和Qubit测量DNA浓度的步骤；所述Master mix含有用于检测EGFR外显子19缺失、外显子21L858R突变、外显子20T790M突变、外显子20C797S突变中一种或多种的引物或探针；所述步骤(3)采用QX200^TM微滴生成仪和DG8^TM微滴发生卡；所述步骤(4)采用PX1^TM PCR封板仪；所述步骤(5)采用C1000Touch^TM PCR热循环仪；所述步骤(6)采用QX200微滴分析仪和QuantaSoft^TM软件。

2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)包括如下步骤：

所述血浆分离步骤包括：

1)将含有外周血的Streck管以1,600×g，4℃离心10分钟，检查血浆是否清洁且无细胞；

2)将约2mL血浆转移到标记管中，将白膜层转移到另一个标记的2mL管中，使白膜层与多余血浆分离；

3)以16,000×g，4℃离心2mL血浆10分钟；将至少1700μl离心的血浆转移到三个标记的2mL管中，在分离过程中避免触及细胞团块；将血浆和白膜层层保存在-20℃；

所述血浆DNA提取步骤包括通过Qubit测量DNA浓度，血浆DNA的Qubit读数在0.1-3ng/μl之内。

3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(2)中Master mix混合液由以下成分组成：

ddPCR Supermix，10μl；

20X Primer and Probe mix，1μl；

UNG，0.2μl；

水，0.8μl；

DNA或水作为NTC阴性对照，8μl；所述Primer and Probe mix为用于检测EGFR外显子19缺失、外显子21 L858R突变、外显子20 T790M突变、外显子20 C797S突变中一种或多种的引物或探针。

4.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(3)具体包括如下步骤：

1)将master mix在室温平衡3分钟，打开密封器并取下密封框架；标记DG8微滴发生卡，将其插入发生卡底座上；

2)在微滴发生卡的中间排，将移液管尖端保持在孔底部边缘，且与孔壁15°角，加入20ul master mix，用20μl 1X缓冲液对照填充空孔；将master mix加入微滴发生卡中，然后将70μl的微滴发生油加载到卡的底部一排；

3)打开QX200液滴生成器，将微滴发生卡底座放入仪器中，开始生成微滴；

4)当微滴生成完成后，取出底座，发生卡的顶部孔中含有微滴，其中中部和底部孔几乎是空的，有少量残油；

5)从底座中取出微滴发生卡，在卡的顶部孔中，将移液管尖端定位在30-45°角及孔的底部边缘，缓慢抽取40.5ul的液滴；

6)在96孔PCR板中，将移液管尖端沿着孔侧壁，靠近孔底部，但不触及底部，缓慢加入微滴，确保96孔PCR板中的孔位置与卡孔的位置相同；

7)转移所有微滴后，丢弃用过的微滴发生卡，并在转移微滴后立即用箔密封PCR板以避免蒸发，检查所有孔中转移微滴的水平是否均匀。

5.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(4)仅采用1个箔密封，将其置于96孔PCR板上，红线朝上并位于顶部。

6.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(5)所述热循环仪的运行程序设置如下：