[发明专利]一种基于微滴数字PCR技术的EGFR检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种利用微滴数字化PCR技术用于检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆中游离DNA(cfDNA)的EGFR基因突变的方法及其应用。本发明提供的Sanomics plasma EGFR检测方法使用非侵入性标本检测EGFR突变，核酸用量较低，最小核酸用量要求仅为10ng，从样本接收到给出结果报告整个检测周转时间仅为2天，具有超高的灵敏度，可检测灵敏度低至0.1％，可同时检测与TKI治疗相关的致敏和抗性突变，如E19缺失、E21 L858R、E20 T790M、E 20 C797S突变，提供突变等位基因频率(MAF)报告。对于NSCLC患者的动态治疗及预后的监测具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种利用微滴数字化PCR技术用于检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者血浆中游离DNA(cfDNA)的EGFR基因突变的方法及其应用。

背景技术

非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80％，是全球癌症死亡的主要原因。大多数NSCLC患者为晚期疾病，以前的研究表明，靶向表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶的可逆抑制剂可有效延缓部分晚期NSCLC患者的疾病进展并提高生存率。随后发现对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的疾病反应性与EGFR激酶结构域中激活突变相关，EGFR激酶结构域由EGFR基因的外显子18至21编码，在这些突变体中，外显子19的阅读框内缺失和外显子21的L858R占临床上重要的EGFR突变的>85％与TKI的反应性相关，而外显子20的T790M占获得性抗TKI治疗的60％。因此治疗前进行EGFR突变检测，筛选具备EGFR-TKIs治疗指征的患者，治疗中持续监测EGFR突变状态的变化，及时发现耐药突变改变治疗策略，对延长NSCLC患者的生存及预测预后有重要意义。

检测EGFR基因突变样本最常用的来源是肿瘤的病理组织或细胞学样本，但是组织取材均为有创操作，难以取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测，且随着疾病的进展、EGFR-TKIs耐药的出现，也不易重复实施。有研究报道血浆游离DNA(cfDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本，因此本发明采用血浆cfDNA样本监测NSCLC患者EGFR基因突变状态，研究EGFR-TKI耐药机制及预测预后的可行性。

然而，采用cfDNA检测EGFR基因突变仍有一些技术上的困难需要克服，如大多数人血浆中cfDNA含量较低，cfDNA片段较小，最大约为180bp，肿瘤相关的DNA占比较小，常规的PCR检测技术灵敏度不足等。

目前可用于EGFR突变检测的PCR相关技术包括Therascreen EGFR Plasma RGQPCR Kit、EGFR Mutation Test v2、IdyllaTM EGFR Mutation Test、Sanger测序、下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)、数字PCR(Digital PCR)等。

获得CE-IVD认证的therascreen EGFR Plasma RGQ PCR试剂盒是用于检测EGFR基因中外显子19缺失和外显子20和21取代突变(分别为T790M和L858R)，并提供突变状态的定性评估。当不能获得组织样品时，从血浆样品中提取cfDNA进行检测，检测结果旨在帮助临床医生识别可能受益于IRESSA(吉非替尼)治疗的NSCLC患者。该试剂盒提供了所有必需的试剂，优化用于在野生型cfDNA背景中快速和灵敏地检测相对低百分比的突变体cfDNA。ARMS PCR技术与Scorpions检测技术相结合(蝎形扩增阻滞突变系统)，为突变检测提供了令人满意的灵敏度和特异性。

EGFR突变检测v2是CE-IVD认证的等位基因特异性实时荧光PCR检测，其鉴定EGFR基因的外显子18,19,20和21中的42个突变，包括T790M抗性突变。PCR反应在3种反应混合物中多路复用。它被设计用于可以使用单个试剂盒检测组织和血浆样本，并允许在同一个板上同时运行组织和血浆检测。单次PCR，不到4小时获得血浆样本检测结果，不到8小时获得组织样本检测结果。