[发明专利]一种产胆固醇氧化酶菌株的筛选方法

说明书

本发明涉及一种细菌筛选的技术领域，具体是一种产胆固醇氧化酶菌株的筛选方法。本发明经初筛，将样品用无菌水稀释后，经过富集，再涂布于以胆固醇为唯一碳源的筛选平板上，挑选能够产生蓝紫色的菌株；再经过复筛，将初筛菌株经活化后接种到发酵培养基中，20‑30℃培养48h测定胞外胆固醇氧化酶活性。本发明筛选方法高效准确，能够获得高产胆固醇氧化酶的菌株；酶活测定方法，操作简便迅速、灵敏度高，同时保证了测定过程中的安全性。

技术领域

本发明涉及一种细菌筛选的技术领域，具体是一种产胆固醇氧化酶菌株的筛选方法。

背景技术

胆固醇氧化酶(3β-羟固醇氧化酶；ChOX，EC1.1.3.6)最早被发现在1943年，是黄素蛋白氧化还原酶家族中的成员之一。该酶主要作用于胆固醇碳3位置，发生氧化脱氢反应，此外它具有异构化酶作用，催化胆固醇氧化后的第一步产物胆甾-5-烯-3-酮发生异构反应生成终产物胆甾-4-烯-3-酮。

近年来，微生物胆固醇氧化酶因其广泛应用于血清胆固醇测定的医学应用而备受关注。由于胆固醇氧化酶对甾醇具有较强的氧化活性，它已被用于临床和食品样品中胆固醇和植物甾醇的测定。目前，胆固醇氧化酶在实验室中有广泛的临床应用，如在食物和血清中定量胆固醇水平，这对动脉粥样硬化、心血管疾病和其他脂类疾病的诊断很重要。此外，胆固醇氧化物酶也被用于许多非甾体化合物、烯丙醇和固醇的生物转化。现在的筛选技术在筛选过程中没有明显的颜色变化，不便于观察；或是利用薄层层析操作繁琐。

发明内容

本发明的目的是针对目前筛选技术的不足环节，提供针对以胆固醇为唯一碳源且大量产生胆固醇氧化酶菌株的一种高效准确的筛选方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

(1)初筛：将样品用无菌水稀释后，经过富集，再涂布于以胆固醇为唯一碳源的筛选平板上，挑选能够产生蓝紫色的菌株；

(2)复筛：将上述初筛菌株经活化后接种到发酵培养基中，20-30℃培养48h测定胞外胆固醇氧化酶活性。

步骤(1)中所述初筛过程的筛选固体培养基成分如下：胆固醇1.5466g/L，酵母膏0.5-10g/L，氯化钠2-10g/L，磷酸二氢钾1-10g/L，磷酸氢二钾0.5-10g/L，硫酸镁0.5-10g/L，淀粉10-20g/L，碘化钾1-10g/L，琼脂20-40g/L。

步骤(2)中所述复筛过程的发酵培养基成分如下：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，胆固醇2g/L，Tween-80 1ml/L，pH6.5。

所述酶活测定过程的测定体系成分如下：2,2-联氮(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(简称ABTS)与HRP混合液3mL，胆固醇工作液200μL，粗酶液50μL。

所述ABTS-HRP混合液配置如下：称取0.0183g ABTS和0.0021g HRP(250U/mg)，用0.05M磷酸钾缓冲液(ph7.2)溶解，定容至100ml。

其特征在于，所述胆固醇工作液配制如下：称取0.0190g胆固醇粉末溶解于脱氧胆酸钠(5％w/v)，定容至10ml。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)筛选方法高效准确，能够获得高产胆固醇氧化酶的菌株；现有的方法在筛选过程中没有明显的颜色变化，不便于观察，而本发明方法在产生胆固醇氧化酶时会有蓝紫色，从而能快速直观的观察到，再根据蓝紫色覆盖的大小和颜色深浅能一定程度上体现出产量。

(2)本发明的酶活测定方法，操作简便迅速、灵敏度高，同时保证了测定过程中的安全性。

附图说明

图1为有蓝紫色透明圈的菌落平板。

具体实施方式