[发明专利]一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用有效
申请号: | 201910272436.9 | 申请日: | 2019-04-04 |
公开(公告)号: | CN111849859B | 公开(公告)日: | 2023-04-07 |
发明(设计)人: | 程新;邓小刚;周莹 | 申请(专利权)人: | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 |
主分类号: | C12N5/071 | 分类号: | C12N5/071;A61K35/407;A61P1/16 |
代理公司: | 北京植众德本知识产权代理有限公司 16083 | 代理人: | 张彦彦 |
地址: | 200031 上海*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基因 编辑 功能 实质 细胞 制备 方法 及其 应用 | ||
1.一种肝实质细胞的制备方法,其特征在于,包括步骤:
(a) 在第一培养条件下,在培养体系中培养内胚层干细胞,从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞;所述内胚层干细胞为经基因编辑的细胞;其中,所述第一培养条件含有第一培养基,所述第一培养基为SFD培养基,其中,在所述SFD培养基中添加50μg/mL的L-抗坏血酸磷酸镁(L-Ascorbic Acid Phosphate Magnesium)、1X的L-谷氨酰胺(L-glutamine)、4.5×10 -4M的MTG、50ng/mL的hBMP4、10ng/mL的bFGF、10ng/mL的hVEGF、10ng/mL的hEGF、25ng/mL的HGF、20ng/mL的TGFa、40ng/mL的地塞米松(Dexamethasone)和1%(v/v)DMSO;
(b) 在第二培养条件下,在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞,从而获得肝母细胞;其中,所述第二培养条件含有第二培养基,所述第二培养基为SFD培养基,其中,在所述SFD培养基中添加50μg/mL的L-抗坏血酸磷酸镁、1X的L-谷氨酰胺、4.5×10 -4M的MTG、50ng/mL的hBMP4、10ng/mL的bFGF、10ng/mL的hVEGF、20ng/mL的hEGF、25ng/mL的HGF、40ng/mL的地塞米松、1%(v/v)DMSO、20ng/mL的OSM、0.1μMC-E、0.5μMA83-01;和
(c) 在第三培养条件下,在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞,从而获得肝实质细胞;其中,所述第三培养条件含有第三3A培养基和第3B培养基,肝母细胞先在第3A培养基中培养,然后再在第3B培养基中培养;其中,第3A培养基为SFD培养基,其中,在所述SFD培养基中添加50μg/mL的L-抗坏血酸磷酸镁、1X的L-谷氨酰胺、4.5×10 -4M的MTG、25ng/mL的HGF、40ng/mL的地塞米松、20ng/mL的OSM、0.1μM的C-E、0.5μM的A83-01、2μM的EGFi、第3B培养基为HCM培养基,其中,在所述HCM培养基中添加50μg/mL的L-抗坏血酸磷酸镁、1X的L-谷氨酰胺、4.5×10 -4M的MTG、40ng/mL的地塞米松、0.1μM的C-E、0.5μM的A83-01、2μM的EGFi;
所述C-E的化学式为C 27H 24F 2N 4O 3,CAS编号为209986-17-4;
所述A83-01的化学式为C 25H 19N 5S,CAS编号为909910-43-6;
所述EGFi化学式为C 22H 23N 3O 4.HCl,CAS编号为183319-69-9。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述经基因编辑的细胞包括经基因纠正的细胞和/或经基因突变的细胞。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述经基因纠正的细胞包括细胞中的ATP7B基因为野生型的ATP7B基因的细胞。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述经基因突变的细胞中的ATP7B基因含有选自下组的一个或多个基因突变位点:
c.2333G>T;
c.2621C>T;
c.2975C>T;
其中,核苷酸位置编号基于野生型人ATP7B编码基因序列其中,核苷酸位置编号基于野生型人ATP7B编码基因序列NG_008806。
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