[发明专利]一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用，具体地，本发明提供了一种肝实质细胞的制备方法，包括步骤：在第一培养基、第二培养基、第三培养基的存在下，在培养体系中培养经基因编辑的内胚层干细胞，从而获得功能性的肝实质细胞。本发明的功能性的肝实质细胞具有非常高的分化率和纯度，并且，本发明的肝实质细胞还具有治疗肝脏相关疾病的作用。

技术领域

本发明涉及生物技术和细胞治疗领域。具体地，本发明涉及一种经基因编辑的功能性肝实质细胞的制备方法及其应用。

背景技术

Wilson’s disease是一种常染色体隐性遗传疾病，与其相关的基因ATP7B编码的是一种P型ATPase，参与细胞内Cu2+的转运。而Wilson’s disease病人ATP7B基因发生异常，导致Cu2+无法正常排泄而在肝脏、脑等组织的大量积累进而引发肝损伤及脑部豆状核变性等。WD的世界范围发病率为1/30 000～1/100 000，在中国较多见。

目前关于Wilson’s disease的治疗主要有药物和肝移植治疗，前者往往只能起到缓解作用并且存在较大的毒副作用和药物依赖性，后者则受制于合适的供体肝源。因此，发展新型的细胞替代治疗，尤其是病人特异性细胞治疗，具有极其重大的临床意义。

WD动物模型Long Evans Cinnamon (LEC)大鼠经移植正常大鼠的原代肝实质细胞后，能够改善其铜离子排泄功能，恢复正常肝功并长期存活，但目前利用人源肝实质细胞治疗WD动物尚无报道。临床实验表明，人原代肝实质细胞移植治疗Crigler–Najjar syndrometype 1等遗传代谢性肝病有效，但受制于供体的匮乏。这表明，肝实质细胞移植治疗包括WD等在内的遗传代谢性肝病在临床上具有一定的可行性，但目前人原代肝实质细胞的获取受限，且异体细胞移植需要长期服用免疫抑制剂。

目前关于Wilson’s disease的治疗主要有两种途径：一、药物性治疗，包括D-penicilillamine、Trientine、Tetrathiomolybdate等，这些药物主要是起到螯合铜从而促进其排泄的作用，此外像Zinc这种药物能够抑制机体对外来铜离子的吸收达到一定的治疗效果(Roberts and Schilsky, 2003)。然而，这些化学药物往往能引起一定的毒副作用，并且具有很强的药物依赖性，无法从根本上治愈；二、肝移植治疗，肝移植治疗被认为可应用于所有对其它药物性治疗无效的Wilson’s disease患者，也是目前治疗急性肝衰竭唯一有效的方法，但长期以来受制于供体肝的稀缺。

因此，本领域迫切需要开发一种特异性针对WD疾病的肝实质细胞的分化方法。

发明内容

本发明公开了一种特异性针对WD疾病的肝实质细胞的分化方法。

在本发明第一方面，提供了一种肝实质细胞的制备方法，包括步骤：

(a) 在第一培养条件下，在培养体系中培养内胚层干细胞，从而获得经肝脏特化的肝向内胚层(Hepatic Endoderm)细胞；所述内胚层干细胞为经基因编辑的细胞；

(b) 在第二培养条件下，在培养体系中培养步骤(a)获得的肝向内胚层(HepaticEndoderm)细胞，从而获得肝母细胞；和

(c)在第三培养条件下，在培养体系中培养步骤(b)获得的肝母细胞，从而获得肝实质细胞。

在另一优选例中，所述经基因编辑的细胞包括经基因纠正的细胞和/或经基因突变的细胞。

在另一优选例中，所述经基因纠正的细胞包括细胞中的ATP7B基因为野生型的ATP7B基因的细胞。

在另一优选例中，所述经基因突变的细胞中的ATP7B基因含有选自下组的一个或多个基因突变位点：