[发明专利]一种新型的单碱基编辑技术及其应用

说明书

本发明提供了一种新型的单碱基编辑技术及其应用。具体地，本发明提供了一种基因编辑酶，其特征在于，所述基因编辑酶的结构如式I所示：Z1‑L1‑Z2‑L2‑Z3‑L3‑Z4 (I)其中，Z1为腺嘌呤脱氨酶TadA的氨基酸序列；Z2为TadA*酶的氨基酸序列；并且所述Z1和/或Z2具有对应于SEQ ID NO:1所示序列的第147位和/或148位的F残基的突变；Z3为Cas9核酸酶的编码序列；L1、L2和L3各自独立地为任选的连接肽序列；Z4为无或核定位信号元件(NLS)；并且各“‑”独立地为肽键。本发明还提供了一种基因单碱基定点编辑的方法。本发明方法的DNA编辑精确度高，并且可显著降低RNA脱靶效应。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种新型的单碱基编辑技术及其应 用。

背景技术

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物 学领域的各个实验，正改变着传统的基因操作手段。

近年来开发的DNA碱基编辑方法能够在基因组DNA中直接产生精确的点 突变，而不会产生双链断裂(DSB)。已经报道了两类基础编辑器：胞嘧啶碱 基编辑器(CBE，C至T和G至A)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE，A至G，T 至C)。然而，其应用还存在关键问题，即脱靶效应。

以前的研究主要集中在评估基因组DNA中的脱靶突变。最近的研究结果 表明，CBE而非ABEs在基因编辑的过程中诱导大量的脱靶单核苷酸突变，强 调了开发更高保真性单碱基编辑工具的必要性。除了DNA靶向活性外，常用 的单碱基编辑系统可能会对RNA进行突变。例如，发现与CBE相关的胞嘧啶 脱氨酶APOBEC1既能靶向DNA又能靶向RNA，并且发现与ABE相关的腺嘌 呤脱氨酶TadA也能诱导RNA上的位点特异性肌苷形成。然而，DNA碱基编 辑介导的RNA靶向活性尚未在之前进行过研究。研究表明，胞嘧啶碱基编辑 器BE3和腺嘌呤碱基编辑器ABE7.10都产生了数万个脱靶RNA单核苷酸变异 (SNV)，而没有碱基编辑的细胞仅表现出几百个SNV。

目前，已有的DNA碱基编辑方法中，DNA编辑的精确度并不高，即基因 编辑窗口过大。哈佛大学的David Liu实验室开发的ABE7.10能够编辑sgRNA 靶向序列的第三到第八个碱基，如果需要编辑的目的碱基旁边还有其他碱基会 被非特异性地编辑。

因此，本领域迫切需要开发一种精确度高、显著降低RNA脱靶效应，并 且能保持有效的DNA靶向活性的单碱基编辑技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种精确度高、显著降低RNA脱靶效应，并且能 保持有效的DNA靶向活性的单碱基编辑技术。

在本发明的第一方面，提供一种腺嘌呤脱氨酶TadA的突变蛋白，所述的突变 蛋白为非天然蛋白，并且所述突变蛋白在腺嘌呤脱氨酶TadA的选自下组的一个或 多个氨基酸发生突变：

第147位苯丙氨酸(F)和第148位苯丙氨酸(F)；

其中，所述第147位和第148位是对应于如SEQ ID NO:1所示的序列的第147位 和第148位。

在另一优选例中，所述的腺嘌呤脱氨酶TadA来源于选自下组的物种：大肠杆 菌(E.coli)、超嗜热菌(A.aeolicus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、酵母CDD1。

在另一优选例中，所述突变蛋白具有催化腺嘌呤水解脱氨基生成次黄嘌呤的 活性。

在另一优选例中，所述的腺嘌呤脱氨酶TadA包括TadA*酶和野生型TadA酶。

在另一优选例中，所述的腺嘌呤脱氨酶TadA为TadA*酶。

在另一优选例中，所述的野生型TadA酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。