[发明专利]一种生物突变体库的构建方法

说明书

本发明公开了一种生物突变体库的构建方法。本发明公开的生物突变体库的构建方法包括：1)向靶标生物中导入DNA片段，得到转基因生物；该DNA片段能在转基因生物中表达完成定点突变靶标DNA的所需的元件；2)培养转基因生物，得到生物突变体库；该生物为有性生殖生物，转基因生物能特异在生殖细胞中定点突变靶标DNA。利用本发明的方法得到的突变体库可筛选到具有以下性状的生物：抗生物逆境，抗非生物逆境，高产量，好品质性状，高次生代谢物产量等。因此，本发明的方法具有巨大的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域中，一种生物突变体库的构建方法。

背景技术

基因编辑技术，特别是CRISPR/Cas9技术，在生物细胞中实现了精准的基因编辑。其技术原理是通过一段引导RNA(sgRNA或gRNA)与DNA内切酶(如Cas9、Cpf1等)结合形成RNA和蛋白的复合物(简称RNP)，该复合物可以在基因组上搜索与引导RNA上互补的目标序列，从而使得DNA内切酶精准地在该区域对结合的DNA进行剪切。根据不同的DNA内切酶特性，剪切的结果多种多样，可以是平末端或粘性末端的双链DNA断裂(DSB)，也可以是单链DNA断裂(Nick)。生物体对DSB或Nick的修复会导致插入或删除(Indel)，从而实现了对靶标基因的精准编辑。

目前具有能够产生不同编辑类型种子的植株均是通过转基因过程直接获得，即农杆菌蘸花法转化得到的T1代拟南芥植株，或者通过组织培养的方法获得的T0代植株。转基因过程的成本高、效率低，很难大量获取这种能够产生不同编辑类型后代的植株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备突变体库。大量的研究表明，针对特定位点产生的DSB的修复结果是产生了大量不同的突变类型。为了能够使这些新的突变基因能够传递到下一代，在生殖细胞中特异地启动打靶，理论上会产生大量含有不同突变基因的后代个体。以植物为例，如果能够持续不断的产生大量的具有不同突变类型的种子，就能够建立一个在该位点的突变体种子库。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种生物突变体库的构建方法，其为X1)或X2)：

所述方法X1)包括下述X11)和X12)：

X11)向靶标生物中导入DNA片段，得到转基因生物；所述DNA片段能在所述转基因生物中表达完成定点突变靶标DNA的所需的元件；

X12)培养所述转基因生物，得到生物突变体库；

所述方法X2)包括下述X21)和X22)：

X21)向靶标生物中导入DNA片段，得到转基因生物；所述DNA片段能在所述转基因生物中表达完成定点突变靶标DNA的所需的元件；

X22)培养所述转基因生物，从所述转基因生物中选择所述靶标DNA发生突变的个体(记为突变体)得到生物突变体库，从所述转基因生物中选择含有所述DNA片段且所述靶标DNA未发生突变的个体(将其记为突变体库储备个体)进行繁殖，以扩大所述突变体库。

所述突变体库储备个体能进一步产生所述靶标DNA发生突变的个体和含有所述DNA片段且所述靶标DNA未发生突变的个体，所述靶标DNA发生突变的个体可作为突变体归入生物突变体库，所述含有所述DNA片段且所述靶标DNA未发生突变的个体可作为突变体库储备个体进一步用于繁殖突变体和突变体库储备个体，并将“产生所述靶标DNA发生突变的个体和含有所述DNA片段且所述靶标DNA未发生突变的个体”的这种特征遗传下去。通过繁殖所述突变体库储备个体，扩大所述突变体库中突变体的数量。所述繁殖的次数可根据具体需要确定。

具体的，所述靶标DNA的特定位点产生突变(即定点突变)可通过DNA内切酶对所述靶标DNA切割后修复DSB产生，也可以是通过碱基脱氨酶或其它可改变碱基的酶来实现。

上述方法中，所述生物可为有性生殖生物或无性生殖生物，如植物、动物、真菌或细菌。