[发明专利]不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系

说明书

本发明公开了不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系。本发明提供了一种利用甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子的方法，包括如下步骤：1)酶解甘蓝型油菜叶片制备得到原生质体；2)将外源核酸分子转入所述原生质体，得到转外源核酸分子的原生质体；再将所述转外源核酸分子的原生质体在C:B培养基中分裂培养，得到由原生质体分裂形成的细胞团；本发明以油菜无菌幼苗为起始材料，采用纤维素酶R‑10和离析酶R‑10，对油菜叶肉组织进行消化并利用密度梯度沉降的方法分离原生质体，获得了高纯度的原生质体。通过聚二乙醇介导将目的基因导入油菜原生质体基因组中，经液体浅层培养以及后续分化再生，培育出大量油菜转基因植株。

技术领域

本发明涉及转基因工程领域，具体涉及不受基因型限制的甘蓝型油菜原生质体分离和遗传转化方法及所用再生体系。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napus L)是重要的油料作物，不仅可用于人类消费，其饼粕还可用于动物饲料等食品业和工业加工。而今，传统育种手段越来越无法满足日益变化的品种需求。油菜品种的进一步改良很大程度上取决于功能基因的拓展广度和深度。体外诱导、细胞融合和遗传转化等原生质体操作手段为遗传变异提供了新的来源(Vamling andGlimelius,1990)，同时体细胞杂交也为远缘物种间的遗传物质交换和重组提供了新的可能(Jourdan and Salazar,1993；Heath and Earle,1997)。时下，基因组编辑技术为功能基因组学研究打开了一个新的领域，与其结合的原生质体转化体系将成为作物改良的有力工具(Voytas and Gao,2104；Jones,2015)。原生质体转化体系的关键在于诱导组织的再生能力，所以甘蓝型油菜的下胚轴和叶片是原生质体分离和培养重要来源。之前的报道主要是利用三个甘蓝型油菜品种的下胚轴获得原生质体再生植株(Glimelius,1984；Kirti,1988；Kirti and Chopra,1988；Pua,1990；Pauk,1991；Olin-Fatih,1996)，基因型依赖性大，转化效率高低不一，试验操作重演性差，而叶肉原生质体再生植株存在极少成功范例(Glimelius,1984；Müller and Sonntag,1998,Sahab et al,2018)。

发明内容

为了提高甘蓝型油菜原生质体转化效率，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供了一种利用甘蓝型油菜原生质体转化外源核酸分子的方法，包括如下步骤：

1)酶解甘蓝型油菜叶片制备得到原生质体；

2)将外源核酸分子转入所述原生质体，得到转外源核酸分子的原生质体；再将所述转外源核酸分子的原生质体在C:B培养基中分裂培养，得到由原生质体分裂形成的细胞团；

所述C:B固体培养基为将C液体培养基和B液体培养基等体积混合，再加入凝固剂，得到C:B固体培养基；