[发明专利]一种紫花苜蓿的遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种紫花苜蓿的遗传转化方法。本发明提供了一种紫花苜蓿遗传转化方法，为用紫花苜蓿的茎尖或含有茎尖的组织作为外植体，进行遗传转化。与现有技术相比，本发明的优点在于：没有采用通过诱导叶片愈伤途径来获取转化苗，而是采用诱导茎尖分化途径来获取转化苗，该方法的优势就是转化周期短，效率高。本发明建立的苜蓿茎尖快速高效诱导体系能够极大的缩减转化周期，并且能够诱导出大量的丛生芽,为苜蓿的高效扩繁体系及遗传转化体系研究提供重要的技术平台和支持。

技术领域

本发明属于植物组织培养及遗传转化技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿的遗传转化方法。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa)，又名苜蓿，是一种多年生的豆科草本牧草。由于其广泛分布欧亚大陆及世界各国，同时其茎叶柔嫩鲜美，深受各类家畜喜食，有‘牧草之王’的美誉。常规育种生产的苜蓿已不能满足社会需求，需要进行转基因遗传育种来定向改良苜蓿的品质及抗逆境胁迫的能力。但苜蓿遗传转化技术一直属于植物基因工程领域的难点，受到多方面因素的限制。常见的苜蓿遗传转化方法是通过诱导愈伤，通过间接器官分化途径来获得转基因株系，但该方法耗费周期长，愈伤不易分化，再生频率低等因素的困扰。如何在提高苜蓿丛生芽的诱发速度的同时提高转化阳性率是技术瓶颈。因此，急需一种直接器官分化途径的方法在短期内高效获取大量优良的紫花苜蓿再生分化苗。

发明内容

为解决现有技术中紫花转化周期长、分化率低的问题，填补了技术空白，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种紫花苜蓿遗传转化方法，为直接用紫花苜蓿的茎尖或含有茎尖的组织作为外植体(无需诱导愈伤组织)，进行遗传转化。

上述方法中，所述方法包括如下步骤：

1)将外源DNA分子转染所述紫花苜蓿的茎尖或含有茎尖的组织，培养，得到侵染后外植体；

具体侵染为将所述紫花苜蓿的茎尖或含有茎尖的组织在含有外源DNA分子的农杆菌中侵染1h；

2)将所述侵染后外植体在含有筛选剂的丛生芽诱导培养基中诱导培养，得到具有丛生芽外植体；

3)将所述具有丛生芽外植体在抗性芽伸长培养基中伸长培养，得到具有抗性芽外植体；

4)将所述具有抗性芽外植体在生根培养基中生根培养，得到再生紫花苜蓿植株，实现紫花苜蓿遗传转化。

上述方法中，所述含有筛选剂的丛生芽诱导培养基包括用于组培的基本培养基、20-30g/L蔗糖、1.4-1.6mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.35-0.45mg/L筛选剂和200-300mg/L抑菌剂。

上述方法中，所述抗性芽伸长培养基包括用于组培的基本培养基、20-30g/L蔗糖、0.05-0.15mg/L吲哚乙酸、0.4-0.6mg/L赤霉素、0.3-0.5mg/L筛选剂、200-300mg/L抑菌剂；

或，所述生根培养基包括用于组培的基本培养基、10-20g/L蔗糖、0.4-0.6mg/L吲哚乙酸、0.3-0.5mg/L筛选剂、100-200mg/L抑菌剂。

上述方法中，所述各个培养基均还包括凝固剂；

或，所述用于组培的基本培养基为用于组培的液体基本培养基；

或，所述含有筛选剂的丛生芽诱导培养基由用于组培的基本培养基、20-30g/L蔗糖、1.4-1.6mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.35-0.45mg/L筛选剂、200-300mg/L抑菌剂和6-7g/L凝固剂组成；

或，所述抗性芽伸长培养基由用于组培的基本培养基、20-30g/L蔗糖、0.05-0.15mg/L吲哚乙酸、0.4-0.6mg/L赤霉素、0.3-0.5mg/L筛选剂、200-300mg/L抑菌剂和6-7g/L凝固剂组成；