[发明专利]一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂

权利要求书

1.一种用于癌症治疗中的药物，其特征在于，所述用于癌症治疗中的药物为BTNL2单克隆治疗型抗体；

所述BTNL2单克隆治疗型抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3；SEQ IDNO.1的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

2.如权利要求1所述的用于癌症治疗中的药物，其特征在于，用于纯化抗体的BTNL2胞外区多肽为免疫原；BTNL2胞外区多肽为氨基酸序列SEQ ID NO.1第24位亮氨酸到第455位丝氨酸或氨基酸序列SEQ ID NO.3第24位赖氨酸到第454位丝氨酸，BTNL2胞外区多肽的编码核苷酸为SEQ ID NO.2所示序列的69-1365位核苷酸或SEQ ID NO.4所示序列的69-1362位核苷酸。

3.如权利要求1所述的用于癌症治疗中的药物，其特征在于，由BTNL2胞外区与6XHis标签组成的融合多肽用于免疫原的纯化。

4.一种如权利要求1所述用于癌症治疗中的药物包含的BTNL2单克隆治疗型抗体构建的表达融合抗原多肽的载体，其特征在于，所述载体为pINFUSE-hIgG2-Fc2，包含编码BTNL2胞外区的核苷酸。

5.一种如权利要求4所述载体的构建方法，其特征在于，所述载体的构建方法包括：将编码BTNL2第24位亮氨酸到第455位丝氨酸的基因序列克隆并利用哺乳动物细胞表达纯化，作为免疫原，免疫小鼠；经与小鼠杂交瘤细胞融合、重组CP4 EPSPS筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系；

利用培养该杂交瘤细胞系收集培养上清，Protein G柱亲和层析纯化培养上清，获得大鼠单克隆抗体；进行免疫印记Western blot实验，分析小鼠单克隆抗体特异识别肿瘤细胞内源的BTNL2蛋白。

6.一种验证权利要求1所述用于癌症治疗中的药物疗效的动物模型构建方法，其特征在于，所述动物模型构建方法包括：

第一步，选取8周龄雌性小鼠做动物实验；小鼠随机分为2-3组，每组10只，一组注射对照抗体，一组注射抗BTNL2抗体，另一组注射抗PD-L1抗体作为阳性对照；

pINFUSE-hIgG2-His-BTNL2载体构建：

通过合成小鼠BTNL2全cDNA序列，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4，以此为模板，构建小鼠BTNL2胞外区表达载体，胞外区氨基酸为第24位赖氨酸到第454位丝氨酸；表达载体为pINFUSE-hIgG2-Fc2；

PCR反应体系为：

10XPCR buffer：5μl，

dNTP：1μl，

上/下游引物：各1ul(10μM)，

模板DNA：1ng，

PFU：1μl

总反应体系：50μl；

PCR反应程序为：

95℃5分钟，循环30次，72℃10分钟，4℃；

将PCR反应体系跑核酸电泳，切胶回收DNA片段；将切胶回收后的DNA片段和pINFUSE-hIgG2-Fc2空载体37℃酶切2小时，回收DNA片段。将回收后的DNA片段和载体进行16℃连接过夜；取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞。转化平板放入37℃细菌孵箱过夜，第二天调取单克隆菌落，进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的菌落提质粒并送公司测序；测序正确的质粒将进行质粒中提，准备转染细胞；DNA切胶回收试剂盒以及DNA溶液回收试剂盒；

重组蛋白His-BTNL2的制备：

将构建好的表达载体pINFUSE-hIgG2-His-BTNL2转染入293F细胞，1L培养细胞，1×10⁶/mL，在37℃、5％CO₂、130rpm摇6天；转染后第6天收取细胞培养上清，离心去除细胞，4℃，1500rpm，5分钟，0.45μm滤膜过滤；将过滤后上清用His-tag纯化试剂盒纯化重组蛋白，超滤后蛋白融在1×PBS里，过0.22μm滤膜，测浓度，-80℃保存；

第二步，杂交瘤细胞系的建立：

a)免疫

将第一步中交联的多肽乳化，免疫6-8周龄雌性大鼠，腹部皮下注射每只大鼠6点，剂量为60ug/只，14天加强免疫一次，抗原乳化，剂量为30ug/只；第3次加强免疫后7天以间接ELISA检测大鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的大鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50ug/只；

免疫大鼠用的抗原为重组His-BTNL2(24-454)抗原蛋白，重组His-BTNL2(24-454)抗原蛋白由序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经动物细胞293F重组表达获得；

b)细胞融合：

无菌制备免疫达标的大鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min；弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入Iml的PEG1500，并搅动细胞；在温水中静置1min后，加入10ml无血清的頂DM，混勾，离心1000rpm，5min；弃上清后，加入10ml血清将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT的胸腺细胞，混匀；再加入25ml含有2.1％硝基纤维素的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中；将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养；

c)挑克隆：

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，吸取圆、实、大的克隆团打入培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养；

d)ELISA筛选阳性杂交瘤细胞：

3天后，细胞量大约占底面积2/3,取IOOyl上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选；阳性克隆完全换液，加入200y1含饲养细胞和1％HT的完全培养基；两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基的24孔板培养；五天后取100y1上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存；获得的小鼠杂交瘤细胞系BTN-1；

e)小鼠杂交瘤细胞系BTN-1分泌的抗体纯化:

利用血清替代物培养小鼠杂交瘤细胞系BTN-1。将5X10⁶细胞转接至10个10cm培养皿，第二天细胞密度约为50％。三天后后去上清，并换为新鲜培养基，继续培养3天，在收取上清。离心去除细胞，0.45μm滤膜过滤。将过滤后上清用protein G预装柱纯化重组蛋白；纯化后的洗脱抗体通过Milipore的超滤株超滤，超滤后抗体融在1×PBS里，过0.22μm滤膜，测浓度，-80℃保存；

f)T细胞激活实验筛选封闭/治疗性BTNL2抗体:

用anti-CD3ePBS和anti-CD28T细胞激活剂包被24孔板，4度过夜；第二天用1XPBS清洗24孔板两次，加入20ug/ml的BTNL2-His蛋白，室温两小时。1XPBS清洗24孔板两次；分离小鼠CD4+T淋巴细胞，将CD4+T种入包被好的24孔板，5X10⁵/孔/1ML；将细胞培养3天，收细胞上清，做ELISA检测IL-2分泌；

g)小鼠皮下瘤的建立及抗体：

8周龄C57BL/6小鼠或者Balb/c小鼠随机分为2组；C57BL/6小鼠在右侧背部皮下接种5X10⁵/100ul PBSde小鼠肠癌细胞MC38，或者3X10⁵/100ul PBSde小鼠肺癌细胞LLC，或者5X10⁵/100ul PBS的小鼠肝癌细胞Hepa1-6；Balb/c小鼠在右侧背部皮下接种5X10⁵/100ulPBS的小鼠乳腺癌细胞4T1；接种后4、7、10、12天分别腹腔注射200ug对照抗体或者抗BTNL2抗体；肿瘤开始测量，肿瘤测量公式是：肿瘤体积＝(长X宽²)/2；并将小鼠生存期绘制成生存曲线。