[发明专利]猪流行性腹泻病毒G1/G2型RT-PCR鉴别引物组及其诊断试剂盒

说明书

本发明公开了猪流行性腹泻病毒G1/G2型RT‑PCR鉴别引物组，包括两对特异性引物，分别是引物PEDV‑BF和PEDV‑BR、引物PEDV‑F和PEDV‑R，分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。据此，发明人还研制了相应诊断试剂盒。应用本发明可在同一反应管内鉴别PEDV G1、G2型的感染类型，为猪群PEDV的准确检测提供了快速简便的工具，为临床快速鉴别检测PEDV G1、G2型毒株及实验室流行病学调查奠定坚实的基础，有助于养猪业准确判断病因及时制定治疗方案，减少经济损失。试验研究表明，本发明特异性好，灵敏度高，重复性好，耗时短且成本低。

技术领域

本发明属于猪流行性腹泻病毒检测技术领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒G1/G2型RT-PCR鉴别引物组及其诊断试剂盒。

背景技术

近年来，随着养猪业向集约化、规模化方向发展，猪群发生腹泻的情况愈加严重。猪流行性腹泻病毒(PEDV)是哺乳仔猪病毒性肠道疾病的主要病原体，其经过长期变异已分为G1型毒株和G2型毒株，G1型毒株疫苗对G2型毒株效果较差，因此及时准确的确诊PEDV感染G1型毒株还是G2型毒株对养猪业具有重要意义。

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪的急性肠道传染病，临床主要表现为水样腹泻和严重脱水，对哺乳期仔猪的发病率高达80～100％，是导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。该病在1976年首次报道于英国，2010年在中国、泰国等亚洲国家爆发了疫情，2013年在美国出现大规模的流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。

研究表明PEDV感染引起猪的腹泻疫病，严重危害养猪生产，而且根据临床症状和流行病学很难区分PEDV G1、G2型毒株，必须依靠实验室检测技术进行鉴别诊断。其中，基因克隆、序列分析等操作比较复杂且等待时间较长；ELISA病原快速检测试剂盒和常规RT-PCR方法的应用比较广泛，但血清学方法准确率较低，常用的单一PCR方法耗时长。

因此，有必要建立能快速鉴别猪流行性腹泻病毒G1、G2型毒株的RT-PCR的早期诊断方法，以便尽快采取有效的防控措施，减少疾病对养猪业造成的危害。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供特异性强、敏感度高、重复性好、耗时短且成本低的猪流行性腹泻病毒G1/G2型RT-PCR鉴别引物组及其诊断试剂盒，便于临床及科研中对猪流行性腹泻G1、G2型毒株的快速检测及流行病学调查。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

猪流行性腹泻病毒G1/G2型RT-PCR鉴别引物组，包括两对特异性引物，分别是引物PEDV-BF和PEDV-BR、引物PEDV-F和PEDV-R，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。

引物PEDV-BF、PEDV-BR、引物PEDV-F和PEDV-R的摩尔比为1：1：1：1。

上述猪流行性腹泻病毒G1/G2型RT-PCR鉴别引物组在PCR扩增方面的应用。

PCR扩增中，引物PEDV-F和PEDV-R为PED通用检测引物，其针对E基因序列为基础在核苷酸的第1-24位和第208-231位处设计；引物PEDV-BF和PEDV-BR为G2型特异性检测引物，其针对G1型与G2型毒株在S基因处的特异性差异，在其核苷酸第164-184位和第982-1003位处设计。

PCR扩增的退火温度为55℃。