[发明专利]猪圆环病毒3型抗体的ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种重组猪圆环病毒3型Cap蛋白，其特征在于，所述的重组猪圆环病毒3型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组猪圆环病毒3型Cap蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、重组猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的克隆及目的基因的筛选：筛选得到基因序列如SEQ ID NO.2所示的PCV3野毒感染猪病料，经过DNA提取和PCR扩增构建得到PCV3 Cap蛋白基因克隆载体；

步骤2、重组猪圆环病毒3型Cap蛋白基因改造：设计剪切引物对，上游引物使得步骤1中的PCV3 Cap蛋白基因5’-端的58个氨基酸编码基因被剪切掉；下游引物使得在PCV3 Cap蛋白基因的3’端融合连接一段来自猪载脂蛋白E的C端氨基酸编码基因序列；其中，所述设计剪切引物对为：

PCV3 Cap Nd58上游引物：其引物序列如SEQ ID NO.3所示，

PCV3 Cap基因3’端融合连接Apo E 3’端15肽下游引物：其引物序列如SEQ ID NO.4所示；

步骤3、构建重组猪圆环病毒3型Cap蛋白表达质粒载体：以步骤1所得的PCV3 Cap蛋白基因PCR扩增产物为模板，用步骤2所得的剪切引物对进行扩增后，将扩增产物插入表达质粒载体pET28a的多克隆位点的BamH I/Hind III切点间，得到重组猪圆环病毒3型Cap蛋白表达质粒载体，该质粒载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

步骤4、构建重组猪圆环病毒3型Cap蛋白表达工程菌；

步骤5、重组猪圆环病毒3型Cap蛋白的诱导表达及纯化，得到该重组猪圆环病毒3型Cap蛋白。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中PCR扩增所用的引物如下：

PCV3 Cap外套上游引物PF：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，

PCV3 Cap外套下游引物PR：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5中具体为：将所述重组猪圆环病毒3型Cap蛋白表达工程菌在培养基中培养，并加入α-乳糖诱导表达后，收菌体，加PBS液后超声波裂解，然后用硫酸铵进行分级沉淀，再收集10％-30％饱和度的硫酸铵沉淀，用PBS液复溶后依次用凝胶柱层析、离子交换层析进行纯化。

5.一种猪圆环病毒3型Cap蛋白表达载体，其特征在于，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.一种猪圆环病毒3型Cap蛋白表达工程菌，其特征在于，该工程菌包含权利要求5所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白表达载体。

7.一种猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的ELISA检测试剂盒包括：

(A)包被有权利要求1所述的重组猪圆环病毒3型Cap蛋白的ELISA酶标板；

(B)标准阴性血清：PCV3抗体阴性的猪血清；

(C)标准阳性血清：PCV3抗体阳性的猪血清；

(D)辣根过氧化物酶标记的酶标二抗：抗猪IgG抗体；

(E)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、ELISA酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。

8.如权利要求7所述的猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗体的ELISA检测试剂盒，其特征在于，重组猪圆环病毒3型Cap蛋白的包被浓度为10μg/ml。

9.权利要求7所述的ELISA检测试剂盒在制备兽医临床产品中的应用，其特征在于，所述兽医临床产品包括PCV3疫苗免疫猪的血清中抗PCV3 Cap蛋白抗体的检测产品。