[发明专利]猪圆环病毒3型抗体的ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了重组猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。该重组PCV3Cap蛋白的制备包括重组猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的克隆及目的基因的筛选；重组猪圆环病毒3型Cap蛋白基因改造；构建重组PCV3Cap蛋白表达质粒载体、工程菌；重组PCV3Cap蛋白的诱导表达及纯化；再用重组PCV3Cap蛋白制备猪圆环病毒3型Cap蛋白抗体ELISA检测试剂盒；该检测试剂盒可准确测定猪体内抗PCV3Cap蛋白抗体。该试剂盒可用于猪场中PCV3流行病学监测，也可用于疫苗免疫后猪血清抗体的检测以协助判断疫苗的免疫效果。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及重组猪圆环病毒3型Cap蛋白、以及重组猪圆环病毒3型Cap蛋白抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科、圆环病毒属，病毒无囊膜、是单链负股环状DNA病毒，是最小的动物病毒之一。到目前为止，已经发现猪圆环病毒存在3个基因型：猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)，和猪圆环病毒3型(PCV3)。其中PCV2和PCV3有致病性，而PCV1无致病性。PCV1和PCV2的氨基酸序列同源性较高，病毒粒子直径约17nm，呈20面体对称结构。基因组大小约为1.76kb，含有2个主要开放性阅读框架(ORF)，其中ORFl基因产物与病毒复制酶相关(involved in virus Caplication，Cap)，ORF2基因产物是构成病毒衣壳蛋白(Capsid protein，简称：Cap)的成分。

猪圆环病毒3型是2015年6月，在美国北卡罗来纳州某猪场患有猪皮炎肾病综合征(PDNS)疫病的病猪体内分离得到的。PCV2与PCV3 Cap蛋白氨基酸同源性仅为30％，两者间不存在交叉免疫保护。PCV3与猪圆环病毒1、2型相似，病毒粒子呈二十面体结构，无囊膜，直径为17-20nm。基因组为单股DNA，全长2 000bp，包含3个主要开放阅读框(ORF)。其中，ORF1编码由297个氨基酸(aa)组成的复制酶蛋白Rep。ORF3编码一个由231个aa组成的蛋白质，编码方向与ORF1基因相同，其功能未知。ORF2编码由214个aa组成的衣壳蛋白Cap，其编码方向与ORF1和ORF3的复制方向相反。PCV3Cap蛋白N端富含精氨酸，为病毒核定位信号区域，与病毒在细胞核内定位有关。PCV3 Cap蛋白为其主要结构蛋白，能够诱导动物机体产生特异性免疫应答，也是病毒感染后检测血清抗体的主要抗原蛋白。

2016年，在我国湖北、广东等地发生繁殖障碍的母猪、以及急性死亡的仔猪病料中检测出PCV3。PCV3感染可导致母猪出现厌食症状，皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，生产性能下降；妊娠母猪发生繁殖障碍，产弱胎、死胎、木乃伊胎和弱仔猪，病情严重甚至造成急性死亡；不同胎龄胎儿均可发生流产。截至目前，我国已有13个省的猪场存在PCV3感染与流行。鉴于PCV3的流行和对养猪业的危害，建立一种PCV3感染和疫苗免疫后抗体的检测方法十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供重组猪圆环病毒3型Cap蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。本发明首先制备得到重组猪圆环病毒3型Cap蛋白，重组PCV3 Cap蛋白分子量约为24kD，经过硫酸铵沉淀，凝胶过滤层析和阴离子交换层析后，目的蛋白纯度达到96％以上。用纯化蛋白包被酶标板后，可通过间接ELISA的方法测定猪体内抗PCV3 Cap蛋白抗体。该试剂盒可用于猪场中PCV3流行病学监测，也可用于疫苗免疫后猪血清抗体的检测以协助判断疫苗的免疫效果。

本发明是这样实现的：

本发明的目的之一，在于提供一种重组猪圆环病毒3型Cap蛋白，所述的重组猪圆环病毒3型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的之二，在于提供重组猪圆环病毒3型Cap蛋白的制备方法，包括如下步骤：