[发明专利]一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法。所述的试剂盒包括RPA反应体系，所述的RPA反应体系包括RPA引物探针混合液，所述RPA引物探针混合液包括一引物对和探针，所述引物对中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明引物特异性强、灵敏度高、检测结果准确。将检测副溶血弧菌的RPA技术与胶体金测流层析试纸条结合能够实现副溶血弧菌的快速检测，能最少检测到10pg的副溶血弧菌DNA。

技术领域

本发明属于食源性致病菌快速诊断技术领域，具体涉及一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是普遍存在于世界海洋和河口环境中的一种嗜盐性革兰阴性菌，是引起沿海地区食物中毒的首要病因。人感染后发病症状有腹泻、恶心、呕吐及发热，甚至脱水昏迷，给人类健康和水产品质量卫生带来极大的安全隐患。随着海产品消售量日益增加，建立副溶血弧菌的快速准确的检测方法，对海产品的质量检测和人类的健康至关重要。能够为疾病的有效治疗和防控争取宝贵时间，最大限速地减少损失和疾病流行的风险。

核酸体外扩增是分子生物学、遗传学、医学等研究领域最常用的技术之一。常规PCR技术以其能够检测DNA而一直被作为诊断多种疫病的金标方法。但是PCR需要特殊的热循环设备，不利于基层推广使用。重组聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification,RPA)技术是由英国公司TwistDx Inc开发的一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。其最显著的优势在于：(1)可在25～43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，并在5～20min内观察结果。(2)RPA技术设备要求低，扩增过程不仅可采用传统的反应管，还可在纸片等反应载体上进行。(3)通过结合探针或横向流动试纸条(LFD)等方法，可实现扩增产物的定量分析或可视化判别。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37-40℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与单链结合蛋白结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA作为一种操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、无需精密仪器的检测技术，是目前最有潜力成为快速分子诊断的工具，其在疾病诊断、食品安全检测、转基因作物检测、病原学检测及防疫现场检测等多个领域中都具有良好的应用前景，而且RPA技术对实验设备的要求非常低，使得该技术在经济条件差，资源不足的区域具有广阔的应用前景。RPA技术在病原学检测领域的研究已经逐渐成为热门。

副溶血弧菌可引起急性感染，常常伴有群体感染和流行的特点，副溶血弧菌诊断方法主要有的分离鉴定、常规PCR、血清学方法和荧光定量PCR等，然而该检测方法周期需要很长时间；常规PCR和荧光定量PCR均需特殊仪器，血清学方法存在敏感性低、特异性差等缺点，无法及时对临床样品进行快速检测，因此无法给临床控制疫病提供及时的指导。因此，迫切寻找一种副溶血弧菌的现场快速检测诊断技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中使用RPA检测副溶血弧菌灵敏度低、且特异性不强等缺陷，提供一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法。本发明的引物和探针特异性强，能够检测副溶血弧菌，为快速检测副溶血弧菌提供一种有效方法，便于食品、环境和临床检测使用，不需要特殊设备的现场诊断新方法。