[发明专利]用于测定重组人生长激素融合蛋白生物学活性的新方法在审
| 申请号： | 201910282012.0 | 申请日： | 2019-04-09 |
| 公开（公告）号： | CN110093451A | 公开（公告）日： | 2019-08-06 |
| 发明（设计）人： | 饶春明;王军志;姚文荣;范文红;于雷;秦玺;史新昌;刘兰 | 申请（专利权）人： | 中国食品药品检定研究院 |
| 主分类号： | C12Q1/6897 | 分类号： | C12Q1/6897;C12Q1/02;C12N15/85 |
| 代理公司： | 北京中知法苑知识产权代理事务所(普通合伙) 11226 | 代理人： | 常玉明;张兰海 |
| 地址： | 100050*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 生长激素 生物学活性 荧光素酶报告基因 重组人生长激素 反应元件 荧光素酶报告基因法 生物学活性测定 变异系数 参数曲线 融合蛋白 稳定表达 荧光信号 灵敏度 细胞株 质量控制 拟合 研发 质粒 转染 激活 刺激 检测 生产 | ||
1.一种应用荧光素酶报告基因法来快速评价生长激素Fc融合蛋白(GH-Fc)生物学活性的方法，其所述方法基于GH及其受体结合后激活JAK2-STATs信号途径，进而结合STAT5反应元件后激活其下游荧光素酶基因的转录。
2.构建的荧光素酶报告基因细胞株包括获得稳定表达STAT5反应元件和GHR的细胞株，加入的GH-Fc蛋白与转基因细胞表面的GHR受体结合，激活反应元件下游荧光素酶报告基因的表达，根据测得的荧光素酶报告基因信号值拟合四参数曲线确定GH-Fc的生物学活性。
3.根据权利要求1和2的快速测定GH-Fc蛋白生物学活性方法，其特征在于：
(1)构建稳定表达STAT5反应元件(本发明命名为SGG1)和GHR的细胞株用于测定GH-Fc蛋白的生物学活性；
(2)将GH-Fc蛋白及参比品稀释至预稀释浓度，3倍比稀释，加入至(1)细胞中，37℃，5％CO2作用；
(3)加入荧光素酶底物，根据测得的荧光值拟合四参数曲线，确定GH-Fc蛋白的生物学活性。
4.根据权利要求1-3所述方法，其中稳定表达SGG1和GHR的细胞株选择HEK293细胞和HeLa细胞，优选为稳定表达SGG1和GHR的HEK293细胞。
5.根据权利要求1-3所述方法，其中报告基因为荧光素酶报告基因。
6.根据权利要求1-3的技术方案，其特征在于：
(1)重悬细胞时采用1640培养液；
(2)铺板细胞数量为2.0-5.0×104/孔，优先4.0×104/孔；
(3)GH-Fc融合蛋白及参比品的稀释液为1640培养液；
(4)用稳定表达SGG1和GHR的HEK293细胞检测时，GH-Fc融合蛋白的预稀释浓度为15μg/mL(15000ng/mL)，3倍比稀释；
(5)加入GH-Fc融合蛋白后，与转基因细胞作用时间为3-6h，优先5h；
(6)检测的是GH-Fc融合蛋白与转基因细胞作用后荧光素酶基因表达的变化；
(7)荧光素酶底物试剂盒有PerkinElmer的Britelite plus和Promega的Bright-Glo，优先PerkinElmer的Britelite plus试剂盒；
(8)酶标仪读取荧光值，通过拟合四参数曲线确定GH-Fc融合蛋白和参比品的EC50值，以相对生物学活性(相对生物学活性＝参比品EC50/样品EC50)反应GH-Fc融合蛋白的生物学活性。
7.权利要求1-6所述方法用于GH-Fc融合蛋白药物生产和研发中的质量控制。
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