[发明专利]用于测定重组人生长激素融合蛋白生物学活性的新方法

说明书

本发明涉及荧光素酶报告基因法测定重组人生长激素Fc融合蛋白的生物学活性。所述方法利用STAT5反应元件(SGG1)和GHR质粒，转染HEK293细胞后获得稳定表达SGG1荧光素酶报告基因和GHR的细胞株，加入生长激素Fc融合蛋白刺激后，激活SGG1反应元件下游荧光素酶报告基因表达，根据荧光信号值拟合四参数曲线确定生长激素Fc融合蛋白的生物学活性。本发明针对生长激素Fc融合蛋白的生物学活性测定建立了易于操作、灵敏度高、变异系数小和准确性高的检测方法，对于生长激素Fc融合蛋白的研发和生产中的质量控制具有重要的指导作用。

技术领域

本发明涉及治疗性重组药生物学活性检测领域，建立了快速、简单和准确的测定重组人生长激素(Growth hormone，GH)融合蛋白生物学活性的方法。

背景技术

GH是一种垂体来源的蛋白质，参与调节生长发育过程中的代谢，其缺乏可以导致儿童生长发育迟缓，成人则为生长激素缺乏综合征，重组人GH可以纠正上述症状。由于GH的半衰期短，需要每日皮下注射，大大增加了治疗者的痛苦。为了延长半衰期，长效化重组蛋白药物成为目前生物技术药物的研发主流；从技术上讲，长效化分主要包括化学修饰(PEG化)和融合蛋白修饰(HSA和抗体Fc片段)两种策略，其中Fc融合蛋白技术是目前研究最多、进展最快的蛋白融合技术。

尽管新型GH药物进展迅速，但尚无快速检测其生物学活性的方法。目前，中国药典中收录的GH生物测定的方法是去垂体大鼠体重法和去出题大鼠胫骨法，两种方法都涉及到大鼠动活体检测，除了不符合动物保护及动物福利的3R原则，实验本身操作复杂，变异系数大，亟需体外细胞学方法替代动物体内法。因此，生物技术药物领域的科研工作者迫切建立建立灵敏、高效、稳定的GH以及类似产品的体外生物学活性检测方法并探索其可行性，从而满足此类产品的注册和评价需求。

本发明采用体外转基因细胞活性测定方法，利用GH-Fc融合蛋白与GHR结合后，进一步活化细胞内的JAK2-STATs、MAPK和PI3K-GSK3等多条明确的信号通路，从而维持细胞的增殖和分化。

本发明选择JAK2-STATs信号通路，在HEK293细胞中转入含有STAT5启动子的荧光素酶报告基因和GHR受体质粒，获得HEK293-GHR-Luc细胞株。GH-Fc与受体结合后激活JAK2-STATs信号通路，从而激活STAT5反应元件下游的荧光素酶基因的转录，荧光素酶基因表达量的强弱与结合至靶细胞膜上GH受体的GH-Fc含量呈正相关。该方法在操作程序、试验周期及变异系数方面，明显优于药典中去垂体大鼠法。

发明内容

本发明是建立一种快速、简便的GH-FC融合蛋白生物学活性的测定方法。该方法包括构建表达GHR和STAT5反应元件(本发明中采用SGG1命名，为本科室构建的质粒)的稳定细胞株，GH-Fc融合蛋白刺激后能够激活STAT5下游荧光素酶报告基因的表达，根据荧光素酶的荧光值拟合四参数曲线，从而确定GH-Fc融合蛋白的生物学活性。

本发明的目的在于提供一种快速测定GH-Fc融合蛋白生物学活性测定方法，所述方法包括：

(1)分别将STAT5反应元件(SGG1)和GHR质粒转入细胞，加压筛选单克隆细胞株，获得稳定表达SGG1和GHR的单克隆细胞株；

(2)将GH-Fc融合蛋白药物稀释，加入至(1)细胞中，37℃刺激5h；

(3)弃去上述(2)中的培养液，加入荧光素酶底物测定荧光值，拟合四参数曲线确定GH-Fc融合蛋白的相对生物学活性。

HEK293细胞是人胚胎肾细胞，广泛应用到药物的研发、生产和科学研究中。HEK293细胞表面表达GHR受体，与GH结合后可以激活JAK2-STATs、MAPK和PI3K-GSK3等多条明确的信号通路，从而促进细胞的增殖和分化等。