[发明专利]一株重组鹦鹉热衣原体外膜蛋白MOMP基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法

权利要求书

1. 一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于，该疫苗免疫动物后能同时实现对布鲁氏菌病和鹦鹉热衣原体病的双重免疫保护；其生产菌株是含有能够高效表达鹦鹉热衣原体外膜蛋白的重组布鲁氏菌RA343-MOMP株；该菌株是通过将P₃启动子与MOMP序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P₃-MOMP序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P₃-MOMP⁺，将鹦鹉热衣原体外膜蛋白MOMP基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因组中，通过氨苄和蔗糖双重筛选，筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其稳定性，获得重组布鲁氏菌RA343-MOMP株，并已于2019年03月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No. 17330。

2.如权利要求1所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于，其生产用重组布鲁氏菌RA343-MOMP株区别于其他细菌的特异性是采用一对分别针对布鲁氏菌基因组和鹦鹉热衣原体MOMP基因的特异性PCR引物，如序列21和序列22所示，扩增出大小为1529bp的特异性片段如序列23所示；

MOMP基因的表达验证是通过实时荧光定量PCR的方式验证MOMP基因转录水平的表达；

通过蛋白印记法验证MOMP基因在蛋白水平的表达；

将重组菌免疫小鼠，监测小鼠体内MOMP抗体的表达情况。

3.如权利要求1所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于，该疫苗的生产方法是用胰蛋白胨大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC No.17330株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.17330株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为布鲁氏菌RA343-MOMP株活疫苗。

4.如权利要求3所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于，该疫苗其中的冻干保护剂，其配方为：PVP 5～15g，BSA 5～15g，海藻糖 50～100g，甘露醇 50g，硫脲 10～15g，维生素C 4g，199培养基2g，磷酸氢二钾 1.25g，磷酸二氢钾 0. 52g，溶于注射用水 1000ml中。

5.如权利要求1所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于，该疫苗免疫效果是通过将疫苗免疫绵羊后，分别采用布鲁氏菌及鹦鹉热衣原体进行攻毒保护试验进行评价。