[发明专利]检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组，其特征在于包含外围引物PPgV–F1、PPgV–R1，内围引物PPgV–F2、PPgV–R2，其核苷酸序列如下所示：

引物PPgV–F1：5′-ACGGTTGGWCGTTTGAGGAG-3′；

引物PPgV–R1：5′-ACAAGCGGAAAGTGACAKGAAT-3′；

引物PPgV–F2：5′-CACCCYTTTATGCTTACTGCC-3′；

引物PPgV–R2：5′-CCCRCGAGCRAAAATCATACC-3′；

其中，K、Y、R、和W表示简并碱基代码，K＝G/T；Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T。

2.权利要求1所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组在检测猪Pegivirus领域中的应用。

3.一种检测猪Pegivirus的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的检测猪Pegivirus的套式RT-PCR引物组。

4.根据权利要求3所述的检测PPgV的试剂盒，其特征在于还包含Primer Script 1step Enzyme Mix、2×1 step Buffer、RNase Free ddH₂O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffer。

5.根据权利要求4所述的检测PPgV的试剂盒，其特征在于包含Primer Script 1 stepEnzyme Mix、2×1 step Buffer、RNase Free ddH₂O、TaKaRa Taq、dNTP Mixture、10×PCRBuffer；浓度为10μmol/L的PPgV–F1、浓度为10μmol/L的PPgV–R1、浓度为10μmol/L的PPgV–F2、浓度为10μmol/L的PPgV–R2。

6.权利要求3～5任一项所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用。

7.根据权利要求6所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，其特征在于包含如下步骤：

(1)以待测样品RNA为模板，以引物PPgV–F₁和引物PPgV–R₁为扩增引物，配制一步法RT-PCR反应体系，进行RT-PCR反应；

(2)以步骤(1)制得的RT-PCR反应产物为模板，以引物PPgV–F₂和引物PPgV–R₂为扩增引物，配制套式PCR反应体系，进行套式PCR反应；

(3)将步骤(2)制得的套式PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在870bp处出现目的条带的判定为阳性扩增，在870bp处未出现目的条带的判定为阴性扩增。

8.根据权利要求7所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的RT-PCR反应的反应体系为：

步骤(1)中所述的RT-PCR反应的反应参数如下所示：

50℃逆转录反应30min；95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min45s，45个循环；72℃延伸10min。

9.根据权利要求7所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，其特征在于：

步骤(2)中所述的套式PCR反应的反应体系为：

10.根据权利要求7所述的检测猪Pegivirus的试剂盒在检测猪Pegivirus领域中的应用，其特征在于：

步骤(2)中所述的套式PCR反应的参数如下所示：

95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min45s，45个循环；72℃延伸10min。