[发明专利]一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用在审
| 申请号： | 201910287012.X | 申请日： | 2019-04-11 |
| 公开（公告）号： | CN110004169A | 公开（公告）日： | 2019-07-12 |
| 发明（设计）人： | 王会征;兰玉彬;韩鑫 | 申请（专利权）人： | 山东理工大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;C07K14/37;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 255086 山东省淄*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 纯蛋白 麦芽糖结合蛋白 目标蛋白 结晶性 难溶 蛋白 亲和层析纯化 生物技术领域 蛋白酶 生物学活性 标签增加 表达载体 蛋白表达 酶活测定 重组蛋白 可溶解 有效地 高酶 蛋白质 应用 切除 标签 | ||
1.一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用，包括：
一种难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法及其应用，其特征在于，难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法包括有下列步骤：
A：将按常规方法表达为难溶蛋白的靶基因
B：实验证明表达出的融合蛋白MBP-Pl101在常规缓冲液A（10mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇）中即可溶，选用淀粉树脂（Amylose Resin）凝胶介质进行亲和层析纯化，并对洗杂液、洗脱液进行不同条件的优化，经实验确定的两种洗杂液分别为缓冲液B（10mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，0.5%(v/v)吐温-20）、C（10mMTris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，1%(v/v) triton-100），洗脱液为缓冲液D（110mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，10mM麦芽糖），洗脱获得重组纯蛋白MBP-Pl101；
C：重组纯蛋白MBP-Pl101用人鼻病毒3C蛋白酶（目标蛋白与酶质量比50：1）将亲和标签麦芽糖结合蛋白MBP切除获得Pl101纯蛋白，纯蛋白经透析袋4℃低温透析的方法将最终缓冲液替换为缓冲液A（10mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，5mM β-巯基乙醇），Pl101纯蛋白经Western blotting杂交验证。
2.根据权利要求1所述的一种难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法及其应用，其特征在于：所述纯蛋白Pl101采用底物聚半乳糖醛酸反应法测定的酶活性为860U/mg。
3.根据权利要求1所述的一种难溶蛋白Pl101的表达、纯化方法及其应用，其特征在于：所述纯蛋白Pl101采用气相扩散、坐滴法进行蛋白结晶实验，在100mM HEPES pH7.5，10%(w/v) PEG6000，5%(v/v) 2-甲基-2，4戊二醇结晶条件下获得Pl101初始蛋白晶体。
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