[发明专利]一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，提供一种按常规表达方法较难溶蛋白质Pl101的表达、纯化方法及其纯蛋白的应用。表达方法是选用pMAL表达载体，通过连接麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein，MBP）标签增加目标蛋白的溶解性，进而表达出可溶解重组蛋白。通过亲和层析纯化的方法获得重组纯蛋白MBP‑Pl101，蛋白酶切除麦芽糖结合蛋白标签，获得可溶性纯蛋白Pl101。对纯蛋白进行酶活测定及结晶性实验，结果表明经此方法表达、纯化出的纯蛋白Pl101具较高酶活性及结晶性。本发明方法快速、简便、有效地获得具生物学活性的目标蛋白，缩短了纯化流程，降低了纯化成本，为难溶蛋白尤其是有结晶等下游操作需求的蛋白表达、纯化提供了技术借鉴。

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供一种按常规表达方法较难溶蛋白质Pl101的表达、纯化方法及其纯蛋白的应用。具体地说，本发明涉及一种源于辣椒疫霉菌的果胶裂解酶Pl101通过pMAL表达载体表达、纯化方法，且所获纯蛋白Pl101具较高酶活性及结晶性。

背景技术

外源基因在原核细胞中表达时，尤其是在大肠杆菌中高效表达时，易形成由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，即包涵体。包涵体的形成是比较复杂的，主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等。功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型，而包涵体内的蛋白是非结晶、无定形的非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。

包涵体的形成对重组蛋白的纯化及酶活测定等下游生化实验的进行带来了很大的障碍，常规实验方法是将包涵体彻底溶解，通过6-8M盐酸胍或8-10M尿素等变性剂变复性的手段获得可溶性蛋白，而上述方法一个不容忽视的问题是蛋白质的收率较低或易造成蛋白的失活等，且纯化成本较高。一种快速、简便且有效纯化包涵体或难溶性蛋白的方法对开展蛋白质组学、酶学尤其是蛋白质晶体学等相关实验可提供有力的技术支持。

亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具，具有结合特异性高、洗脱条件温和、纯化倍数高等显著优点。然而常用的多聚组氨酸（6-His）、谷胱甘肽硫转酶（GST）等标签对包涵体蛋白、难溶蛋白的增溶效果较差，且通过变复性或添加增溶剂的方式不利于对所获纯蛋白开展蛋白质晶体学等相关实验。使用对难溶蛋白增溶效果较好的麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein，MBP）标签进行相关纯化利于开展蛋白结晶等下游实验。

果胶裂解酶（Pectate lyase，Pl）为辣椒疫霉菌（Photophthora capsici）等植物病原菌的重要细胞壁降解酶，属植物病原菌的关键致病因子，通过降解寄主细胞壁来增强病原菌对寄主的亲和力，从而引起致病。Pl能够降解植物细胞壁中的果胶，对病原菌侵染寄主植物具重要作用。研究发现，Pl对甲酯化的果胶分子亲和力较高，通过β-消除的方式裂解甲酯基的α-1，4糖苷键，生成在非还原末端的C4和C5位置有不饱和双键的半乳糖醛酸。对果胶裂解酶Pl的功能研究已成为分子植物病理学的热点科学问题。

蛋白质功能特性均通过其肽链上特异氨基酸功能基团实现完成，而蛋白质三级结构通过特异性折叠等形成的特定分子结构，决定了不同氨基酸残基的空间分布与结构位置，因此立足蛋白结构生物学研究，更易于探明Pl遗传本质与调控机理。而蛋白结构生物学研究的提前是获得目的蛋白晶体，即通过基因、表达纯化后获得纯蛋白进行结晶实验。