[发明专利]一种表面展示猪轮状病毒VP7蛋白的重组类干酪乳杆菌的构建及其应用

说明书

本发明涉及一种表面展示猪轮状病毒VP7蛋白的重组类干酪乳杆菌，是在类干酪乳杆菌的基因组中插入猪轮状病毒VP7蛋白的基因序列。本发明还提供了上述重组类干酪乳杆菌的构建方法以及应用。本发明通过获取猪轮状病毒VP7全长基因序列，构建重组类干酪乳杆菌，选择口服方式免疫小鼠与仔猪，并对该重组菌的免疫效果进行评价，结果表现为增强了抗原表位的免疫效果，为制备口服轮状病毒基因工程乳酸菌的研究提供可行性依据。

技术领域

本发明属于动物分子生物学领域，涉及一种表面展示猪轮状病毒VP7蛋白的重组类干酪乳杆菌的构建及其应用。

背景技术

猪轮状病毒(简称PoRV)感染多发生于寒冷季节，是一种地方流行性传染病，病猪是主要传染源，5～10d就能从感染猪的粪便中发现PoRV的抗体。经粪-口途径传播，大猪多为隐性感染，15～35d的仔猪易感，自然情况下感染轮状病毒的猪可产生循环抗体，母猪经母乳将轮状病毒抗体过继给仔猪，使仔猪获得母源抗体，时长3～5周，初产母猪的仔猪与经产母猪的仔猪相比，感染猪轮状病毒的几率高。

目前市面上的PoRV疫苗包括以细胞(MA104)扩繁的低毒力的病毒经灭活，然后用佐剂(矿物油)制成油佐剂灭活苗，用于怀孕母猪生产前一个月免疫以及仔猪出生后的第一周和第三周各免疫一次；另一类是美国Ambico公司研制的弱毒苗，10倍的TCID₅₀/mL的病毒量，免疫接种(口服或肌肉注射)，母猪在分娩前2周和第5周各接种1次。以上两种类别的疫苗通过生产验证，发现给需免猪免疫弱毒苗，可以阻止和预防PoRV感染，并且攻毒试验中疫苗保护率很高，而灭活苗与其相比各项验证结果都低。

DNA疫苗也称为基因疫苗，是将一种或几种目的基因，运用基因重组技术克隆到载体上形成重组DNA，直达宿主体内，并长期表达获得免疫。研究较多的蛋白包括VP7、VP4和VP6。其中VP4蛋白是中和抗原，在自然感染的情况下，可使机体产生中和抗体。VP6蛋白为群抗原，有较高的抗原性，可产生非中和的IgA抗体。VP7蛋白是中和抗原，也是一种糖蛋白，免疫后使机体产生中和抗体，是现今研究猪轮状病毒基因工程苗首选基因。基因疫苗与其它疫苗比，其可同时使机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答，并且与亚单位疫苗同样安全，与弱毒苗一样有效，制备简单，易于保存，进入机体后免疫反应性良好，因此受到高度重视。

类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei,L.paracasei)是肠道益生菌，具有激活淋巴细胞、刺激抗体产生等与获得性免疫相关的功能，保护肠道微生物菌群的平衡，是食品级微生物。以其作为黏膜疫苗递送载体可以表达同源和异源蛋白质，能够诱发局部黏膜免疫和全身的体液免疫，还起到黏膜佐剂的作用，例如重组菌株表达的酶无需经过纯化即可应用于饲料添加剂。类干酪乳杆菌主要通过黏膜途径进入机体，因此，以类干酪乳杆菌作为抗原递送载体研发黏膜疫苗对该病的防控具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种表面展示猪轮状病毒VP7蛋白的重组类干酪乳杆菌，解决轮状病毒通过黏膜感染动物，防控困难大的问题。

本发明的第二目的是提供上述表面展示猪轮状病毒VP7蛋白的重组类干酪乳杆菌的构建方法。

本发明的第三目的是提供上述表面展示猪轮状病毒VP7蛋白的重组类干酪乳杆菌的应用。

本发明的第四目的是提供上述表面展示猪轮状病毒VP7蛋白的重组类干酪乳杆菌的给药方式。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种表面展示猪轮状病毒VP7蛋白的重组类干酪乳杆菌，是在类干酪乳杆菌的基因组中插入猪轮状病毒VP7蛋白的基因序列。

进一步的，猪轮状病毒VP7蛋白的基因序列如SEQ ID No.1所示。

二、一种根据上述的表面展示猪轮状病毒VP7蛋白的重组类干酪乳杆菌的构建方法，该方法包括以下步骤：