[发明专利]一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用

权利要求书

1.一种分离的基因片段，其特征在于：该基因片段同时包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，第二核苷酸序列为SEQ IDNO.4；所述SEQ ID NO.1来源于新鞘脂菌（Novosphingobium aromaticivorans）DSM 12444，所述SEQ ID NO.2来源于红球菌属（Rhodococcus sp.）M8。

2.如权利要求1所述基因片段编码的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物。

3.一种串联重组表达载体，其包含权利要求1所述的基因片段。

4.包含权利要求3所述串联重组表达载体的转化体。

5.权利要求2所述组合物在制备盐酸甲氧那明关键中间体上的应用。

6.一种大肠杆菌串联重组表达菌株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）通过PCR扩增获得第一核苷酸序列，选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的任意一个核苷酸序列；通过PCR扩增获得SEQ ID NO.4的第二核苷酸序列；所述SEQ ID NO.1来源于新鞘脂菌（Novosphingobium aromaticivorans）DSM 12444，所述SEQ ID NO.2来源于红球菌属（Rhodococcus sp.）M8；

（2）将第一核苷酸序列与预先用NcoI和NotI双酶切的pRSFDuet-1质粒进行同源重组，再用NdeI和XhoI双酶切，纯化后与第二核苷酸序列连接，获得串联重组质粒；

（3）将上述串联重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，获得大肠杆菌串联重组表达菌株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，

扩增第一核苷酸序列的引物为：

SDR-P：5’-taataaggagatataccatggcaCCGCTTGAAATGACGATTGC-3’，

SDR-R：5’-cgacttaagcattatgcggccgcTCAGACCTGGCTGAAGCCGC-3’；或

ADH-P：5’-taataaggagatataccatggcaAAAGCGGTGCAGTATACGG-3’，

ADH-R：5’-cgacttaagcattatgcggccgcTTACGGCACGACAACGCCGCGAC-3’；

扩增第二核苷酸序列的引物为：

GDH-P：5’-gtataagaaggagatatacatatgTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3’，

GDH-R：5’-ggtttctttaccagactcgagTTAACCGCGGCCTGCCTGGAATG-3’。

8.一种氧化还原酶粗酶液，其特征在于通过如下方法制备获得：

挑取权利要求7所述方法制备获得的大肠杆菌串联重组表达菌株的单菌落，接入含有卡那霉素的LB培养基中，过夜培养；再将过夜培养物接种于含有卡那霉素的TB培养基中震荡培养，至发酵液OD₆₀₀达到0.6~0.8时，加入IPTG诱导培养，发酵后离心收集菌体，PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎后再离心，收集上清液，获得氧化还原酶粗酶液。

9.一种生物催化制备盐酸甲氧那明的方法，其特征在于：以2-甲氧基苯丙酮为底物，投入质量比1%~10%的权利要求8所述的氧化还原酶粗酶液，30~37℃下反应1~24小时，分离纯化获得2-甲氧基苯基异丙醇，再经羟基保护、甲基氨基化并去保护、通入HCl气体获得盐酸甲氧那明。