[发明专利]一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用

说明书

本发明公开了一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用，将化学法和酶法技术相结合，开发出一条反应条件温和，生产安全，反应收率高，三废排放少，反应后处理简单，易于实现工业化生产的技术。此外，对生物催化所需的酶通过基因工程技术构建得到串联表达重组菌株，实现一菌双酶表达的效果，大大减少了规模化生产中酶的生产成本。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体地说涉及一种羰基还原酶、基因及其在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用。

背景技术

哮喘是最常见的呼吸道疾病，是由于过敏、循环系统或肺的充血、支气管水肿、肾或心脏的疾患以及中枢神经系统的激动等各种病因引起的疾病。多表现为发作性咳嗽、胸闷及呼吸困难。

盐酸甲氧那明，具有松弛支气管平滑肌解除支气管痉挛的作用。其平喘作用强于麻黄碱，中枢兴奋及心血管方面则较弱。在临床上主要以复方制剂用于支气管哮喘特别是不能耐受麻黄碱者。它的结构式如下：

盐酸甲氧那明为β肾上腺素受体激动药，目前盐酸甲氧那明原料药在中国市场上的售价比较昂贵，制备盐酸甲氧那明的传统方法以邻甲氧基苯甲醛为起始原料，在碱性条件下与硝基乙烷缩合，然后用铁与三氯化铁的化合物在盐酸作用下还原成邻甲氧基苯丙酮，最后加入甲胺的盐酸盐，用硼氢化钠还原胺化，得到盐酸甲氧那明。该工艺用到的原料硝基乙烷以及催化剂氧化铂均价格较贵，而三氯化铁和铁的使用将产生大量的废水、废渣，对环境危害较大。

国外目前的报道的合成方法多采用金属催化氢化反应：Heinzelman R.V.报道了一种合成方法(Journal of the American Chemical Society，1953，75：921-5)，2-甲氧基苯基丙酮，用氧化铂作催化剂，甲胺溶于甲醇中(7.7％浓度)，在三个大气压的条件下加压氢化反应1～3小时，产物2-甲氧基苯基异丙醇的收率80％。ZenichiH等报道了另外的一个合成方法(Yakugaku Zasshi，1957，77：256-8.)，2-甲氧基苯基丙酮3g和20g30％的甲胺甲醇溶液，在雷尼镍和二氯化铂的催化氢化下得到1.6g产物2-甲氧基苯基异丙醇，收率为40％。上述用2-甲氧基苯丙酮和甲胺甲醇反应的方法中，要用到氧化铂，二氯化铂，钯碳作为催化剂，价格昂贵，会显著增加生产成本，且加氢过程易燃易爆，危险性较高。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种多克隆位点编码的分离的基因片段，本发明另一个目的是前述基因片段编码的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物，本发明再一个目的是提供包含前述核酸的串联重组表达载体，本发明再一个目的是提供前述串联重组表达载体的转化体；本发明再一个目的是提供前述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶组合物在盐酸甲氧那明关键中间体上的应用，本发明再一个目的是提供前述转化体的制备方法及通过该方法制备获得的氧化还原酶粗酶液。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种分离的基因片段，该基因片段同时包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，第二核苷酸序列为sEQID NO.4。

所述SEQ ID NO.1来源于新鞘脂菌Novosphingobium aromaticivorans DSM12444的还原酶SDR(GenBank：CP000677.1)；

所述SEQ ID NO.2来源于红球菌属Rhodococcus sp.M8的甲醇脱氢酶ADH(GenBank：OLL16747.1)，其兼具羰基还原酶的活性；

所述SEQ ID NO.3来源于类高加索酸奶乳杆菌Lactobacillus parakefiriDSM10551的r-型特异性的甲醇脱氢酶rADH(GenBank：KRL73676.1)，其兼具羰基还原酶的活性；