[发明专利]一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法

说明书

本发明公开了一种双重DNA机器检测microRNA‑21的方法。所述方法包括：在microRNA‑21存在的情况下，采用T4连接酶将5’端磷酸化处理的锁式探针连接形成环状DNA模板；并在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶的同时作用下引发环状DNA机器运转，得到单链产物；使所述单链产物与回文发夹探针杂交，得到杂交双链，并实现双向DNA机器的循环链置换扩增，得到扩增产物；对反应体系中扩增产物的荧光信号进行检测，获得microRNA‑21的浓度。本发明具有很高的miRNA‑21检测灵敏度，检测限为10fM，而且具有良好的特异性，是一种通用的核酸检测平台。

技术领域

本发明属于生命健康领域，涉及肿瘤标志物microRNA-21的检测方法，具体涉及一种基于RCA的环状DNA机器和基于循环链置换扩增的双向DNA机器相联合的双重DNA机器检测microRNA-21的荧光检测方法。

背景技术

microRNA是一类短而小但在生物体内发挥重要作用的内源性非编码RNA，与基因调控、细胞分裂和凋亡等各种生物过程息息相关。研究表明，许多疾病的发生都伴随着microRNA表达种类或含量的改变，这种改变在癌症中表现的尤为明显。因此，microRNA被认为是癌症检测的新型标志物，建立灵敏、可靠、有效和准确的microRNA检测方法对于癌症早期诊断、治疗和癌症机理研究等多种领域有着极为重要的研究及现实意义。目前的常规检测方法如逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量逆转录酶-聚合酶链反应（qRT-PCR）、分子印迹和微阵列分析等技术由于成本较高、操作繁琐、过程复杂且灵敏度低、特异性差等，很难满足超微量microRNA的临床检测要求。因此，开发操作简单、成本低、检测性能好等优良性质的microRNA检测新方法与新技术具有十足的必要性。

发明内容

为解决microRNA检测的操作复杂性、检测限灵敏度不够高等问题，本发明建立了一种基于滚环扩增（RCA）的环状DNA机器和基于循环链置换扩增的双向DNA机器相联合的双重DNA机器检测microRNA-21的荧光检测方法。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法，其包括：

在microRNA-21存在的情况下，采用T4连接酶将5’端磷酸化处理的锁式探针连接形成环状DNA模板；并在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶的同时作用下引发环状DNA机器运转，得到单链产物；

使所述单链产物与回文发夹探针杂交，得到杂交双链，且使杂交双链中回文发夹探针的3’端进行分子间互补配对，在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶作用下实现双向DNA机器的循环链置换扩增，得到扩增产物；

对反应体系中扩增产物的荧光信号进行检测，获得microRNA-21的浓度。

在一些实施例中，所述方法具体包括：

（1）将T4连接酶缓冲液、5’端磷酸化处理的锁式探针、microRNA-21和去离子水均匀混合，使所得混合物于90～95℃加热2～5 min，冷却至室温，再加入5～10 U T4连接酶，之后使所得第一反应体系于16～25℃反应30～60 min，形成环状DNA模板；

（2）使包含步骤（1）所获第一反应体系、1-2 μL DNA聚合酶缓冲液、1～2 μL回文发夹探针、1～2 μL dNTPs、3～5 μL DNA聚合酶和5～10 U 限制性核酸内切酶的第二反应体系于30～37℃孵育反应1～2.5 h，得到扩增产物；

（3）根据步骤（1）和（2），对一系列不同浓度microRNA-21标准溶液进行定量检测，测定扩增产物在激发光波段的荧光强度值，获得microRNA-21浓度-荧光强度值标准曲线；