[发明专利]一种基于稳定同位素检测的无标记核酸酶分析方法

说明书

本发明提供一种基于稳定同位素检测的无标记分析方法，以及其在核酸酶检测方面的应用。在核酸酶的存在下，合成CuNPs的模板DNA序列被酶切，酶切后的DNA碎片失去模板作用，在抗坏血酸和铜离子作用下无法合成CuNPs。合成的CuNPs通过硝酸消解后形成铜离子，可进行ICPMS定量分析。本发明提供了一种可以对核酸酶实现长时间稳定无标记检测的分析方法，可以保持分析信号长时间稳定不衰减，具有成本较低，省去繁琐操作步骤、响应快速的优势，同时利用ICPMS对稳定同位素检测的检出限低、稳定性优异的优点，在提高对核酸酶检测的灵敏度的同时，大大提高了长时间稳定性，可以实现长时间稳定检测和实时监控。

技术领域

本发明属于分析化学的检测领域，涉及核酸酶的稳定同位素（Metal stableisotope）传感领域，特别设计一种基于脱氧核糖核酸（DNA）作为模板原位合成铜纳米粒子（CuNPs）产生的稳定同位素通过电感耦合等离子体质谱仪对核酸酶的检测方法。

背景技术

核酸酶是一系列具有高特异性剪切、操控脱氧核糖核酸（DNA）结构变化能力的生物酶，包括核酸连接酶、端粒酶、内切酶、外切酶等。建立对核酸酶的高灵敏度检测对于DNA的复制、重组、修复、基因分型和测序都有重要的意义。

在现在建立的对核酸酶的分析方法中，基于单链、双链DNA模板法原位合成具有荧光性质铜纳米粒子的无标记分析法，因其操作简单、合成动力学快速、较高的量子产率和较大的斯托克斯位移（Stokes shift）吸引了广泛的研究关注，并成功建立了以此方法为基础的对DNase、核酸酶S1、T4多核苷酸激酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ的荧光光谱法检测。尽管基于DNA模板法合成CuNPs的荧光光谱法检测已经成功用于多种核酸酶的无标记检测中，但所合成的CuNPs稳定性不高（相对荧光强度在1小时内衰减超过80%）仍然是制约这一方法应用于长时间检测和实时监测的关键桎梏。

为克服这一制约，本发明结合电感耦合等离子体质谱仪（Inductive CoupledPlasma Mass Spectrometry, ICPMS）检出限低（大部分元素都可以达到pg mL^-1级别）、基体效应小、线性范围广（高达九个数量级）、稳定性优异的优点，将DNA模板法合成的CuNPs酸消解后进行稳定同位素检测，在保持优秀的检出限性能同时，大幅度提高了检测稳定性，为核酸酶的检测提出了一种更可靠的分析方法。

发明内容

本发明提供一种基于稳定同位素检测的无标记分析方法，以及其在核酸酶检测方面的应用。

本发明的原理是：在核酸酶的存在下，合成CuNPs的模板DNA序列被酶切，酶切后的DNA碎片失去模板作用，在抗坏血酸（AA）和铜离子作用下无法合成CuNPs；反之，当核酸酶不存在时，模板DNA序列得以保留，在AA和铜离子作用下可以合成CuNPs。合成的CuNPs通过硝酸消解后形成铜离子，可进行ICPMS定量分析。通过不同浓度的核酸酶产生的铜元素的同位素强度的变化进行线性回归分析，即可对核酸酶进行稳定同位素检测。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明制备CuNPs的原理是：利用不同核酸酶的特异性切割对象设计筛选DNA模板。将功能化的可以原位合成CuNPs的DNA模板和磁性微球（MBs）组装在一起，样品核酸酶在缓冲溶液中和DNA模板进行反应，发生酶切，被酶切成碎片的DNA碎片无法继续作为模板后续合成CuNPs；未被酶切的DNA模板和随后加入的还原剂抗坏血酸（AA）和硫酸铜溶液可快速合成CuNPs。

对合成的CuNPs进行酸消解和稳定同位素检测方法为：磁性分离后，利用一定浓度的硝酸对CuNPs进行消解，形成的铜离子进行ICPMS高灵敏检测。选取⁶³Cu同位素作为检测对象进行高灵敏定量分析。通过不同浓度的核酸酶引起的⁶³Cu同位素强度值进行线性回归分析，即可对待测核酸酶进行定量分析。