[发明专利]一种复制可控型流感病毒的检测方法

权利要求书

1.一种复制可控型流感病毒的定量检测方法，其特征在于：将待测病毒液与生产用细胞共培养，随后提取总RNA并逆转录为cDNA，最后根据已知拷贝数的野生型病毒qPCR的Ct值结果绘制标准曲线，代入复制可控型流感病毒的Ct值，计算获得流感病毒拷贝数。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于野生型病毒为流感病毒H1N1的A/WSN/1933株，且检测野生型病毒和复制可控型流感病毒的qPCR引物均为下列引物:

Ben3-FP：5’-CAAATGTCCAAAGAAGTAAATGCTAGA-3’(SEQ ID NO:23)；

Ben3-RP：5’-GGCATCCATCAGCAGGAATT-3’(SEQ ID NO:24)。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用DMEM+10％FBS培养基于33-38℃，5％CO₂静置培养293T细胞或Vero细胞24小时；

(2)加入待测病毒液并于33-38℃，5％CO₂静置孵育2小时；

(3)TRNzol法提取RNA；

(4)将RNA反转录为cDNA；

(5)通过qPCR反应体系测量待测样品的Ct值，根据已知拷贝数的野生型病毒作为标准品进行qPCR并绘制标准曲线，将待测样品的Ct值带入回归曲线并获得相应拷贝数；

所述Ct值为每个反应管内的荧光信号到达设定值时所经历的循环数。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)按如下方案进行：

(i)配制含有随机引物和寡核苷酸引物以及待测RNA的反应体系1，以及含有MgCl₂、缓冲液、dNTP、重组RNA酶抑制剂以及AMV逆转录酶的反应体系2；

(ii)将反应体系1离心于管底，在常规PCR仪上70℃孵育5min，完成后立即置于冰上3min；

(iii)将反应体系2加入到反应体系1中，25℃孵育5min，42℃孵育50min，70℃孵育15min，4℃备用。

5.如权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于：

所述复制可控型流感病毒，通过将病毒拯救系统导入哺乳动物宿主细胞的方式获得，所述哺乳动物宿主细胞稳定整合流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因，流感病毒拯救系统中携带突变型PA、PB1、PB2和NP基因，所述突变使得流感病毒拯救系统不能在天然哺乳动物细胞中拯救获得完整病毒。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述流感病毒拯救系统包括编码突变型PA、PB1、PB2和NP基因的重组质粒以及编码HA、NA、M、NS四种基因的重组质粒，所述突变通过分别在四个基因序列中引入TAG密码子实现。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述稳定整合到宿主细胞的PA、PB1、PB2和NP基因以及流感病毒拯救系统中的病毒编码基因均来自流感病毒H1N1的A/WSN/1933株。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述稳定整合到宿主细胞的PA、PB1、PB2和NP基因的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述流感病毒拯救系统包括如下八个质粒：pPolI-WSN-PB、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-HA；pPolI-WSN-NA；pPolI-WSN-M；pPolI-WSN-NS，其中，所含有的PA基因存在R266密码子突变为TAG、PB1基因存在R52密码子突变为TAG)、PB2基因存在K33密码子突变为TAG和NP基因存在D101密码子突变为TAG。