[发明专利]一种复制可控型流感病毒的检测方法

说明书

本发明涉及一种复制可控型流感病毒的检测方法。待检测的病毒通过病毒拯救的方式获得，在稳定整合并表达流感病毒PA、PB1、PB2和NP基因的细胞株中引入复制可控的流感病毒拯救系统，该系统包含在PA、PB1、PB2和NP基因中分别引入了终止密码子的质粒。该检测方法的特点在于通过生产用细胞实现病毒复制增殖，再通过qPCR方法测量并代入根据野生型病毒测量获得的Ct值曲线获得病毒量。该检测方法具有较强的特异性、较好的重复性和较高的精密度。

技术领域

本发明涉及流感病毒技术领域，具体涉及一种复制可控型流感病毒的检测方法。

背景技术

流行性感冒(流感)是由流感病毒(Influenza virus)导致的呼吸道和其他脏器的疾病，在健康儿童和成人中，每年均会在春冬季，甚至其它季节有不同程度的流行，通常是一种急性、传染性的疾病。

流感病毒是导致流感的病原体，属于负链单股RNA病毒，其基因组共有8个独立的RNA片段(分别以片段1-8命名)组成，核酸总长度约为13.6kb。这8个片段共编码10种蛋白质，其中8种为结构蛋白，包括PB1、PB2、PA、HA、NA、NP、M1、M2,而NS1、NS2为非结构蛋白。流感病毒分为人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。

病毒复制主要依靠病毒核糖核蛋白(vRNPs)。甲型流感病毒的核糖核蛋白由病毒RNA、RNA聚合酶(RdRp)复合体以及核蛋白(NP)组成，是病毒的最小复制单位，病毒蛋白在该结构基础上才能表达。vRNPs结构中的RdRp由3个亚基(PA、PB2、PB1)组成，PB1位于三聚体的核心，其N末端和C末端分别与PA亚基的C末端以及PB2亚基的N末端通过非共价键(如疏水作用、氢键、范德华力等)形成稳定的蛋白质复合物。

尽管治疗流感病毒可以使用各类抗病毒药物，但由于流感病毒快速变异，世界各地每年有流感的散发流行和暴发，正确接种流感疫苗可以有效的减少流感发病率。

目前，流感疫苗按照其种类可分为：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。全病毒灭活疫苗、裂解疫苗，因流感快速变异，需要每年在爆发季节前，对当年可能爆发的毒株进行预测，准确预测有一定难度，预测错误，将导致疫苗保护率大幅度下降，而且，即便准确预测，也因为目前主要采用的鸡胚生产工艺，病毒产生的鸡胚适应性变异，导致疫苗保护效率不高；对于亚单位疫苗，由于目前并没有发现流感病毒可以用于疫苗的保守序列，导致进展缓慢。

因此，迫切需要更具有安全性并更好的保留全病毒免疫活性的流感疫苗及其生产方法的问世。在此基础上，也需要一种专门针对复制可控型流感病毒的检测方法，实现在疫苗生产以及疫苗使用过程中流感病毒有效性和安全性的控制。

发明内容

本发明的目的在于通过特定哺乳动物细胞生产流感病毒，以用于疫苗制备，并通过特定检测方法实现对所述流感病毒的检测。所述流感病毒由于引入突变而不能在正常哺乳动物细胞中增殖，只能在整合了外源病毒蛋白基因的宿主细胞中增殖。

为达到上述目的，本发明向哺乳动物细胞中转入特定的基因，获得稳定表达相应的流感病毒蛋白的宿主细胞，再转染相关基因突变后的流感病毒拯救系统，拯救获得复制可控的新型流感活病毒。为实现该类特殊病毒的检测，本发明利用qPCR方法针对所述病毒基因组的特点设计相应引物，以实现快速准确的检测。

具体而言，本发明提供如下技术方案：

首先，本发明提供一种复制可控型流感病毒的定量检测方法，将待测病毒液与生产用细胞共培养，随后提取总RNA并逆转录为cDNA，最后根据已知拷贝数的野生型病毒qPCR的Ct值结果绘制标准曲线，代入复制可控型流感病毒的Ct值，计算获得流感病毒拷贝数优选的，野生型病毒为流感病毒H1N1的A/WSN/1933株，且检测野生型病毒和复制可控型流感病毒的qPCR引物均为下列引物: