[发明专利]超敏检测NAs治疗下乙型肝炎病毒DNA的寡核苷酸组合物、试剂盒、方法及用途

说明书

本发明公开用于超敏检测核苷(酸)类药物(nucleos(t)ide analogues，NAs)治疗下乙型肝炎病毒DNA的寡核苷酸组合物、试剂盒和方法及用途。其中寡核苷酸组合物包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，或者与第一寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸和与第二寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸；第一和第二寡核苷酸序列之间的距离为30‑350nt，第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列均为HBV X区序列。本发明可以超敏检测核苷(酸)类药物治疗下HBV DNA的水平。

技术领域

本发明涉及乙型肝炎病毒核酸的检测，具体地涉及用于超敏检测核苷(酸)类药物(nucleos(t)ide analogues，NAs)治疗后血清中乙型肝炎病毒水平，精准监测病毒学反弹的寡核苷酸组合物、试剂盒、方法和用途。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性流行，不同地区HBV感染的流行强度差异很大。根据病毒基因组序列相似度，HBV至少分为10个基因型(A～J)。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者。我国属于中高流行区，HBV感染以B型和C型为主。在2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查中，我国1～59岁一般人群HBsAg携带率为7.18％。据此推算，我国慢性 HBV感染者约为9300万人，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者约2000万例。HBV持续感染引起慢性乙型肝炎(CHB)，也是肝硬化和肝细胞癌(HCC)发生发展的重要因素。在我国，一半以上的肝硬化和HCC患者由HBV引起。

HBV属嗜肝DNA病毒科，是已知最小的真核细胞DNA病毒之一，基因组为一全长约3.2kb(3182—3248，不同基因型病毒基因组序列长度有所不同)的不完全闭合环形 DNA(rcDNA)，双链长度不对称，单链部分占全长的15～50％。HBV子代病毒DNA 合成以前基因组RNA(pgRNA)为模板进行逆转录，逆转录起始位置从pgRNA的3’末端DR1区起始并逐步延伸，同时模板RNA逐步降解。HBV负链合成完成后开始合成正链，正链DNA以负链为模板，以残余5’端pgRNA为引物，从负链DR2区向负链5’端延伸至末尾，然后跳转至负链3’末端继续延伸合成正链(图1)。

血清中HBV DNA水平能反映HBV的复制水平，可作为一个抗病毒疗效的监测指标，且有较好的预后监测价值(Martinot-Peignoux M,Marcellin P.Virological andserological tools to optimize the management of patients with chronichepatitis B[J].Liver International, 2016,36Suppl 1(Supplement S1):78–84.)。在中国《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》中提到，HBV DNA定量检测主要用于判断慢性HBV感染的病毒复制水平，可用于抗病毒治疗适应症的选择、病毒学应答及疗效的判断，并建议采用灵敏度和精确度高的实时荧光定量聚合酶链式反应。

目前用于治疗CHB的药物主要为核苷(酸)类药物(NAs)，比如拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV，一线推荐药物)和替诺福韦(TDF，一线推荐药物)等。其主要通过抑制病毒的逆转录和DNA合成发挥抗病毒作用，从而显著降低病毒载量。

根据HBV病毒基因组结构和复制特征，由于HBV X基因离负链逆转录起始位置最近，治疗过程中被NAs类药物阻断概率最小，对NAs类药物应答相对迟缓。同理，X基因在病毒学反弹情况下也更容易或更早被观察到。这种新的指标来标示NAs治疗后病人体内剩余病毒DNA水平更加精准，同时判断病毒学反弹更具有前瞻性。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种新的检测体系，其可以超敏检测核苷(酸)类药物治疗下乙型肝炎病毒DNA的水平。具体地，本发明包括以下内容。