[发明专利]一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法

权利要求书

1.一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法，其特征在于：具体检测方法如下：

第一步：提取标准羊肉和待测羊肉样品DNA：分别取25～50只滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊的肌肉组织分别研磨成粉末，分别加到离心管中，加入细胞裂解液，离心处理至样品完全裂解，待用，其中提取的滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊羊肉样品DNA为标准样品DNA；再次分别提取滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊共计324只绵羊肉样品DNA，记为待测样品DNA；

第二步：分别检测提取的标准样品DNA和待测样品DNA羊肉样品DNA浓度：分别提取第一步中裂解后的标准样品DNA和待测样品DNA各1-5μL分别加入微量核酸蛋白浓度测定仪测定提取的DNA的纯度；

第三步：对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记：采用MISA软件对上述第一步中提取的标准样品DNA和待测样品DNA进行SSR序列检测，分别选取标准样品DNA和待测样品DNA中的SSR基因序列，采用Primer3对选取的SSR基因序列进行荧光标记，得到标准样品DNA的SSR基因序列荧光标记引物和待测样品DNA的SSR基因序列荧光标记引物；

第四步：利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增：提取第一步中裂解后的标准样品DNA和待测样品DNA各0.5-1.5μg，分别向其中加入2×TaqPlusMasterMix10-15μL、第三步已合成的SSR基因序列荧光标记引物、上游引物0.3-0.8μL、下游引物0.3-0.8μL、，并且通过ddH₂O定容至25μL，将制得的PCR反应体系进行PCR扩增；

第五步：琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果：称取1％琼脂糖溶液制为琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中向其中加入1×TAE电泳缓冲，分别将第四步PCR扩增后的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列均匀点样在琼脂糖凝胶中，将琼脂糖凝胶置于电泳检测仪上进行成像分析，检测标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的PCR扩增情况；

第六步：毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型：采用3730xl设备分别检测PCR扩增后的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图；

第七步：构建STR-SSR标准分型峰值谱图；根据第六步检测的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图峰形图，将待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图的峰形位置和峰值大小确定与标准样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图的峰形位置和峰值大小判断待测羊肉的种类。

2.根据权利要求1所述的一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法，其特征在于：第三步中所述的对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记采用的荧光标记试剂为FAM试剂和HEX试剂。

3.根据权利要求1所述的一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增的具体步骤如下：将第四步中制得的PCR反应体系条件在90℃-100℃预变性1-5min，在90℃-100℃变性20-40s，在55℃-65℃退火20s-40s，在70℃-74℃延伸20-40s，上述过程重复操作15-30次，再在70℃-74℃修复延申4-8min。

4.根据权利要求1所述的一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法，其特征在于：第六步中所述的毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型的具体步骤如下：量取900-1000uL HIDI溶液和5uL-15uL LIZ500溶液混合均匀，加入到96孔反应板中，每孔加入10uL；将96孔板置于平板离心机中，1100-1300rmp离心10s；使用12排10μL排枪，对照STR检测表，在96孔板对应的孔中加入40pg-50pg的PCR扩增后的标准样品DNA或待测样品DNA；将96孔板置于平板离心机中，1100-1300rmp离心10s；使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，1100-1300rmp离心10s，进行毛细管电泳检测。