[发明专利]一种评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法

权利要求书

1.一种评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，利用无菌松材线虫对所诱导的松树胚性细胞进行接种，通过愈伤组织外观形态变化、TTC细胞化学染色结果、线虫种群增长速率，比较不同细胞系对松材线虫的响应，从而筛选出抗性细胞系，淘汰敏感细胞系，实现在愈伤组织阶段就对松树胚性细胞的抗松材线虫特性进行早期评价。

2.根据权利要求1所述的评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备无细菌松材线虫，备用；

(2)培养松树愈伤组织，备用；

(3)取旺盛增殖的松树愈伤组织，接种无菌松材线虫，黑暗条件下，共培养；

(4)培养预定时间后，观察愈伤组织外观变化，发现不同愈伤组织对松材线虫的响应不同，根据与线虫共培养后愈伤组织的外观形态，将愈伤组织对线虫的响应分为四类；

(5)取愈伤组织，采用2,3,5－三苯基氯化四氮唑进行细胞化学染色，观察结果；

(6)贝尔曼漏斗法分离线虫，统计松材线虫增殖数量；

(7)结合步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)的结果，对所检测的不同细胞系愈伤组织的抗松材线虫特性进行比较，获得松树愈伤组织对松材线虫抗性的评价结果。

3.根据权利要求1所述的评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中，制备PDA培养基，接种灰葡萄孢到培养基上，在25℃下经过5-7d培养，灰葡萄孢菌丝铺满平板后将松材线虫接种其中，25℃下培养5-7d，待松材线虫大量繁殖后采用贝尔曼漏斗法分离松材线虫，收集于无菌的离心管中，离心，去上清，再用无菌水清洗，离心，重复3-5次，最终保留2-3ml松材线虫悬浮液，采用ZL201010550230.7方法制备无细菌松材线虫，调节浓度至20000条/mL。

4.根据权利要求1所述的评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，步骤(3)中，取旺盛增殖的松树愈伤组织，接种10μL无菌松材线虫于每块愈伤组织，等体积无菌水为对照，25℃、黑暗条件下，共培养10天。

5.根据权利要求1所述的评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，步骤(4)中，对线虫的响应分为四类，分别为：

第一类，水渍化严重，愈伤组织完全坍塌，失去原有的团块形状，但未观察到明显的褐变现象；

第二类，水渍化严重，愈伤组织完全坍塌，失去原有的团块形状，且发生明显的褐变现象；

第三类，愈伤组织发生明显的褐变现象，但水渍化不严重，未发生坍塌；

第四类，愈伤组织未发生褐变和水渍化。

6.根据权利要求1所述的评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，步骤(5)中，取0.1g愈伤组织于2.0mL离心管中，采用2,3,5－三苯基氯化四氮唑进行细胞化学染色，12h后观察结果。

7.根据权利要求1所述的评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，步骤(5)中，经TTC染色呈无色，表明愈伤组织已完全丧失活力，对松材线虫较为敏感；呈淡粉红色，表明其还有部分活力，对松材线虫具有一定抗性；呈鲜红色，表明其活力依然很强，对松材线虫具有较强的抗性。

8.根据权利要求1所述的评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，步骤(6)中，松材线虫增殖数量≤5000条，对松材线虫具有较强的抗性；松材线虫增殖数量≥15000条，对松材线虫较为敏感性；松材线虫增殖数量介于＞5000条且小于15000条，对松材线虫具有一定的抗性。

9.根据权利要求1所述的评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，步骤(7)中，松树愈伤组织对线虫的响应为第四类，且经TTC染色呈鲜红色，且松材线虫增殖数量≤5000条，评价为对松材线虫具有较强的抗性。