[发明专利]一种评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法

说明书

本发明公开了一种评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法，其特征在于，利用无菌松材线虫对所诱导的松树胚性细胞系进行接种，通过愈伤组织外观形态变化、TTC细胞化学染色结果、线虫种群增长速率，比较不同细胞系对松材线虫的响应，从而筛选出抗性细胞系，淘汰敏感细胞系，实现在愈伤组织阶段就对松树胚性细胞的抗松材线虫特性进行早期评价。本发明利用无菌松材线虫对所诱导的松树胚性细胞系进行接种，通过愈伤组织外观形态变化、TTC细胞化学染色结果、线虫种群增长速率，比较不同细胞系对松材线虫的响应，从而筛选出抗性细胞系，淘汰敏感细胞系，在愈伤组织阶段就对其抗松材线虫特性进行早期评价，是一种简便、快速的愈伤组织抗松材线虫特性评价方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种评价松树愈伤组织对松材线虫抗性的方法。

背景技术

松材线虫病是松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的毁灭性重大森林病害，是我国建国以来发生最严重和最危险的重大传染性森林病害，也是国际国内重大的森林植物检疫对象。目前主要分布在美国、加拿大、日本、中国、韩国、葡萄牙和西班牙等国家(Mota et al.，1999；Abelleira et al.，2011)。我国于1982年首次发现松材线虫病，三十多年来，该病害迅速扩散到南方多个省(区)，并逐步向北方省份蔓延。2018年全国共有18个省588个县级行政区发生松材线虫病疫情。该病害不仅危害松属树种，也危害落叶松属树种(于海英，2018)，对我国9亿亩松林资源造成严重威胁，对生态系统造成了极大破坏，生产上迄今尚无经济可行的化学、物理或生物防治手段对其进行有效控制。

抗病育种是病害防治的重要途径之一。针对松材线虫病，国内外均开展了抗病选育工作并取得了显著成效，建立了抗病基因库和种子园。然而抗病种子生产周期长、产量有限，且可能性状分离而不能保持亲本优良性状，因此优良抗病材料如何规模化应用于生产已成为松树抗病育种事业发展中的瓶颈。

植物组织培养技术，尤其是体细胞胚胎发生植株再生技术，具有繁殖速度快，可全年连续生产等优点，已成为良种繁育的重要捷径。体细胞胚胎发生植株再生途径是双或单倍体的体细胞在特定条件下未经细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育形成像受精卵那样的体细胞胚胎，在适宜条件下成熟并“萌发”成完整植株的结构，通常包含胚性愈伤组织的诱导、胚性愈伤组织的增殖、成熟和萌发四个阶段。自Hakman和von Arnold(1985)首次报道由欧洲云杉的未成熟合子胚培养中获得体细胞胚并再生出植株以来，针叶树的体细胞胚发生研究已取得了令人瞩目的进展。松属树种体细胞胚胎发生研究也取得了突破性的进展。1986年，Gupta以5年生糖松成熟胚为外植体建立了细胞悬浮系并分离出胚性愈伤组织，首次经体细胞胚胎发生途径获得了完整植株。1987年，Gupta等以火炬松未成熟胚为外植体实现了火炬松的体细胞胚胎发生和植株再生(Gupta et al，1987)。随后在湿地松、美国五针松、辐射松、洪都拉斯加勒比松、南欧黑松、日本赤松、日本黑松、马尾松、云南松等多个松种建立了体细胞胚胎发生体系。针对抗病松树体细胞胚胎发生，亦取得较大进展。2000年，Percy对抗松疱锈病加州山松(Pinus monticola)未成熟胚进行体细胞胚胎发生研究，建立了300个胚性细胞系。孙婷玉等(2015)对抗松材线虫病黑松未成熟合子胚体细胞胚胎发生进行了相关研究，吴静等(2015)以抗松材线虫病赤松未成熟胚为材料诱导并获得了可稳定增殖的多个胚性细胞系，陈婷婷等(2019)以抗松材线虫病马尾松未成熟胚为材料建立了体细胞胚胎发生植株再生体系。

综上所述，目前国内对松属树种的体细胞胚胎发生进行了研究，获得了大量胚性细胞系。然而，这些细胞系多以合子胚为材料建立的，由于合子胚的杂合性，其诱导产生的愈伤组织分化形成的再生植株的性状例如抗病性等需经过漫长的田间试验检测后才能确定。因此，急需开发一种早期抗性检测方法以筛选出优良抗性细胞系，从而加速抗病育种进程，为生产上尽快提供大批可广为应用的抗病良种。Jang等(1990)比较了然而，尚无有关针对松树愈伤组织抗松材线虫特性评价的方法。

发明内容