[发明专利]药物损伤DNA功能化磁性纳米亲和探针及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及药物损伤DNA应答蛋白的富集、分离和检测领域，公开了药物损伤DNA功能化磁性纳米亲和探针及其制备方法和在捕获与鉴定药物损伤DNA的应答蛋白中的应用；亲和探针包括磁性纳米颗粒、偶联结构和负载在所述磁性纳米颗粒表面的药物损伤DNA，偶联结构为所述磁性纳米颗粒修饰的第一化学反应活性基团与所述药物损伤DNA修饰的第二化学反应活性基团通过化学反应而共价键合得到的结构。该亲和探针结构非常稳定且分离简便、快速、温和，只需少量细胞全蛋白提取液即可实现高特异性捕获。此外，该探针具有普适性，可应用于任何通过共价键或配位键结合造成DNA药物损伤的应答蛋白的捕获和鉴定。

技术领域

本发明涉及蛋白质富集、分离和检测领域。具体地，涉及一种药物损伤DNA功能化磁性纳米亲和探针及其制备方法和该亲和探针在捕获与鉴定药物损伤DNA的应答蛋白中的应用。

背景技术

自1969年美国密西根州立大学的Rosenberg教授等发现了顺铂(Cisplatin)的抗肿瘤活性以来，顺铂已成为临床上使用最为广泛的抗癌药物之一，其代表的铂类抗癌药物是细胞毒性癌症化疗药物的典范。第二代铂类药物卡铂、奥沙利铂等也已相继进入临床使用。大量研究表明顺铂及其类似物的最终作用靶标为细胞核内的DNA。顺铂进入人体后，通过被动扩散进入细胞并发生水解，生成的水合物被转运至细胞核，然后与DNA上鸟嘌呤、腺嘌呤发生配位，形成铂-DNA复合物，其中1,2-链内交联复合物约占90％。通过与DNA形成交联复合物，顺铂能阻碍DNA复制和转录，诱导细胞凋亡从而产生抗肿瘤活性。当细胞核内的DNA遭受到顺铂的损伤，细胞必然对此作出应答反应。细胞内铂化DNA应答蛋白主要有参与损伤修复过程的蛋白，如hMutS,DNA依赖的蛋白激酶等；高迁移率族蛋白，如HMGB1，在上世纪八十年代末就被发现是一种能与顺铂交联DNA特异性相互作用的DNA结合蛋白，体外实验表明HMGB1可能通过与损伤位点结合使损伤DNA不能被修复系统识别，从而抑制顺铂与DNA形成的1,2-链内交联产物被核酸切除修复；其他蛋白如TATA结合蛋白(TBP)、聚(ADP-核糖)聚合酶1(PARP-1)、p53蛋白等，也被发现倾向于识别顺铂损伤的DNA。这些铂化DNA应答蛋白在结构和功能上彼此通讯，对顺铂的抗肿瘤活性产生了重要影响。因此从分子水平上研究细胞对铂类药物损伤DNA的应答对深入理解细胞毒性抗癌药物的作用机理，进一步优化它们的分子设计具有重要的意义。

目前，捕获铂损伤DNA应答蛋白的方法有亲和富集技术，光交联技术和纳米亲和探针捕获技术。光交联技术是利用具有光反应活性的苯甲酮基团来捕获铂损伤DNA附近的蛋白，这种方法灵敏度高，但是由于光捕获基团连接在顺铂分子上，无法设置合理的对照探针来排除非特异性结合蛋白；亲和富集技术是将铂损伤的DNA连接到微米级的固相颗粒表面，再将颗粒装填到柱子中，运用亲和色谱的方法来捕获特异性识别铂化DNA的蛋白，这种方法便于设置对照实验，但是所需的细胞裂解液较多；纳米亲和探针捕获技术之前是将药物损伤DNA固定到纳米金上，与细胞裂解液孵育，然后通过高速离心分离得到捕获的蛋白质。但是由于纳米金是通过与巯基形成金硫键来构建探针，这样生物体内源性的一些含巯基的分子可能会影响探针的稳定性。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种通用，且同时兼顾灵敏、稳定、无需大量细胞全蛋白提取液且便于设置对照的药物损伤DNA功能化磁性纳米亲和探针及其制备方法与应用。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种药物损伤DNA功能化磁性纳米亲和探针，其中，该亲和探针包括磁性纳米颗粒、偶联结构和负载在所述磁性纳米颗粒表面的药物损伤DNA，其中，所述偶联结构的一端与所述磁性纳米颗粒相连，另一端与所述药物损伤DNA相连，且所述偶联结构为所述磁性纳米颗粒修饰的第一化学反应活性基团与所述药物损伤DNA修饰的第二化学反应活性基团通过化学反应而共价键合得到的结构。

本发明第二方面提供一种药物损伤DNA功能化磁性纳米亲和探针的制备方法，其中，该制备方法包括以下步骤，

(1)将药物与DNA进行第一接触，得到药物损伤DNA；