[发明专利]不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素Ⅱ的表达试验方法

权利要求书

1.不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，实验材料包括6只健康的12月龄绵羊，实验包括如下步骤：

S1：试验动物及样品采集

将每只绵羊后臀部的被毛剪掉，并用剃毛刀小心刮净表皮，后用取皮器取绵羊皮肤样品快速放入液氮，用于下一步的试验；另取皮肤样品分别置于4％多聚甲醛固定液中，24h后，将固定的样品转移到70％的酒精溶液中，用于后续的试验；

S2：试验试剂的配制

配置电泳缓冲液、转膜缓冲液、TBST缓冲液、5％的封闭液、4％浓缩胶、10％分离胶和12％分离胶；

S3：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白的提取

将液氮中的绵羊皮肤组织置于研钵中充分研磨；称量研磨好的组织，根据重量加入500-1,000μL的组织提取裂解液，用力震荡后，将EP管置于冰上，充分裂解组织；约1h后，用4℃离心机以12,000r·min^-1离心5min后，小心吸取上清液，分装于新的EP管中，存放于-20℃；

S4：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白浓度的测定

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取的总蛋白的浓度；

S5：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及抗体孵育

配制10％的分离胶和4％的浓缩胶；根据每个样品的蛋白浓度，计算各样品的上样量，并加入5×Loading buffer，95℃，10min蛋白变性；将变性好的样品溶液和蛋白Marker加入孔中，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V电压跑至分离胶和浓缩胶的交界处，再换用120V电压跑至溴酚蓝到达距离分离胶底部约1cm处；100V恒压转膜1.5h；将标记好的NC膜放入封闭液中脱色摇床上封闭1h；用TBST稀释兔抗AngII多克隆抗体(1∶300)，4℃孵育，过夜；将NC膜放入二抗(1∶5,000)中，在37℃恒温摇床中孵育1h；二抗孵育结束后，将NC膜取出，用TBST洗10min×3次；待清洗完毕后，将NC膜放置于展开的保鲜膜上，将配制好的ECL发光液覆盖于整个膜上进行显定影，扫描采集图片；

S6：不同毛色绵羊皮肤组织的包埋及切片制作

用取皮器取绵羊背部皮肤组织，用镊子将组织样品摊平，小心将其放入4％多聚甲醛固定液中，组织样品固定24h；将皮肤样品进行梯度脱水；

S7：不同毛色绵羊皮肤组织的免疫组织化学方法

提前将切好的片子放入烘箱，37℃恒温烘4-5h；切片经二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水处理；用枸橼酸盐缓冲液对切片组织进行抗原热修复10min，PBS洗5min×2次；在组织样品上滴加适量的3％H₂O₂，37℃恒温孵育10min，PBS洗3次，每次3min，将组织切片放置在保湿盒中，滴加适量的封闭液，室温孵育30min；滴加一抗(1∶50)，4℃过夜，用PBS做阴性对照；从4℃取出后，放置在37℃的烘箱中，孵育30min；滴加适量的二抗，37℃恒温孵育30min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃恒温孵育20min；滴加配制好的DAB显色试剂；用苏木精进行轻度复染，复染时间为10min；梯度酒精脱水和二甲苯透明处理，中性树脂封片处理；显微镜下观察，阳性为棕黄色，分别获取组织样品的阳性、阴性图像；

S8：数据处理与统计分析

所有数据使用SPSS 17.0软件进行分析，统计分析基于ANOVA，Duncan方法进行多重比较，使用SigmaPlot 12.5对数据转换成图表处理，结果用平均值±标准误差表示，ImagePro Plus 7.0图像分析软件用于处理免疫组织化学结果。

2.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，12月龄绵羊分别为3只白色和3只黑色，均为雌性。

3.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，电泳缓冲液、转膜缓冲液以及TBST缓冲液均由蒸馏水定容至1 000mL，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，其特征在于，4％浓缩胶的配方为H₂O 2mL、30％Acr-Bis 0.5mL、0.5mol/L Tris·HCl 0.5mL、10％SDS 40mL、10％过硫酸铵30mL、TEMED 4mL。