[发明专利]不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素Ⅱ的表达试验方法

说明书

本发明公开了不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，实验材料包括6只健康的12月龄绵羊，实验包括如下步骤：试验动物及样品采集；试验试剂的配制；白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白的提取；白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白浓度的测定；SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳及抗体孵育；不同毛色绵羊皮肤组织的包埋及切片制作；不同毛色绵羊皮肤组织的免疫组织化学方法；数据处理与统计分析。本发明采用免疫组织化学法对白色和黑色绵羊皮肤中AngII进行定位，免疫组织化学结果显示，AngII蛋白在黑色绵羊毛囊中真皮乳头和外根鞘部的表达量均高于白色皮肤，因此，验证了AngII蛋白参与绵羊被毛颜色的形成，为研究AngII蛋白在绵羊被毛颜色的形成中的作用提供了理论依据。

技术领域

本发明涉及血管紧张素II的试验方法，特别涉及不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法。

背景技术

血管紧张素II(Angiotensin II，Ang II)是一种多肽物质，在血管紧张素转化酶的作用下由血管紧张素I水解产生。Ang II是肾素-血管紧张素系统中最为重要的生物活性物质。近年来，一些学者发现Ang II具有促进纤维化、促进生长增值和免疫调节等非血流动力学的作用。Ang II主要存在于肝细胞，包括一些其他的组织器官，如：肺、肾脏、睾丸、血管壁、心肌和皮肤等。有研究发现，Ang II能促进成纤维细胞胶原合成的增加，表明Ang II参与了皮肤的纤维化，进一步证实Ang II存在于人的皮肤中。之前的研究已经揭示Ang II的另一个作用就是可以调控皮肤的创伤愈合。有学者采用人的黑色素细胞，进行检测Ang II对黑色素合成的影响，结果发现皮肤创伤愈合的异常色素沉着与Ang II有一定的关系。

就目前的研究成果，仍然缺乏研究AngII蛋白在绵羊被毛颜色形成中的作用的思路及理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，本发明验证了AngII蛋白参与绵羊被毛颜色的形成，为研究AngII蛋白在绵羊被毛颜色的形成中的作用提供了理论依据，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：不同毛色绵羊皮肤中血管紧张素II的表达试验方法，实验材料包括6只健康的12月龄绵羊，实验包括如下步骤：

S1：试验动物及样品采集

将每只绵羊后臀部的被毛剪掉，并用剃毛刀小心刮净表皮，后用取皮器取绵羊皮肤样品快速放入液氮，用于下一步的试验；另取皮肤样品分别置于4％多聚甲醛固定液中，24h后，将固定的样品转移到70％的酒精溶液中，用于后续的试验；

S2：试验试剂的配制，

配置电泳缓冲液、转膜缓冲液、TBST缓冲液、5％的封闭液、4％浓缩胶、10％分离胶和12％分离胶；

S3：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白的提取

将液氮中的绵羊皮肤组织置于研钵中充分研磨；称量研磨好的组织，根据重量加入500-1,000μL的组织提取裂解液，用力震荡后，将EP管置于冰上，充分裂解组织；约1h后，用4℃离心机以12 000r·min^-1离心5min后，小心吸取上清液，分装于新的EP管中，存放于-20℃；

S4：白色和黑色绵羊皮肤组织总蛋白浓度的测定

利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取的总蛋白的浓度；

S5：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及抗体孵育