[发明专利]一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法

权利要求书

1.适用于高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的特异性引物对，所述五种皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1-2所示的序列或其特异性序列。

2.含有权利要求1所述特异性引物对的试剂盒或检测试剂。

3.权利要求1所述特异性引物对在制备鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporumincurvatum的试剂盒或检测试剂中的应用。

4.权利要求1所述的特异性引物对在保障食品安全或环境卫生监测中的应用。

5.一种鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的特异性引物对，以待测样品的DNA为模板，使用Real-time PCR方法进行检测，根据熔解峰值图中熔解曲线的峰形判定结果。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，Real-time PCR方法中30μL PCR反应体系为：2×Mix Taqman PCR Master 15μL、上下游引物各0.9μL、100×Rox Reference Dye Ⅱ 0.3μL、Evagreen，20×in Water1.5μL、待测DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，Real-time PCR反应条件为：预变性：95℃10min；95℃15s，65℃45s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，熔解曲线制作条件为：95℃10s，60℃1min，0.025℃/s升温至95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，同时连续检测荧光强度；以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。

9.如权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，每一种特异性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的皮肤癣菌，

其中，Tm值在82-85℃范围内出现熔解峰为红色毛癣菌(T.rubrum)检出；

Tm值在83-85℃范围内出现熔解峰为趾间毛癣菌(T.interdigitale)检出；

Tm值在84-87℃范围内出现熔解峰为絮状表皮癣菌(E.floccosum)检出；

Tm值在88-90℃范围内出现熔解峰为犬小孢子菌(M.canis)检出；

Tm值在86-88℃范围内出现熔解峰为Microsporum incurvatum检出。

10.用于鉴别五种皮肤癣菌的靶序列组合，所述五种皮肤癣菌分别为红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum，其特征在于，

用于鉴定红色毛癣菌(T.rubrum)的靶序列含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

用于鉴定趾间毛癣菌(T.interdigitale)的靶序列含有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

用于鉴定絮状表皮癣菌(E.floccosum)的靶序列含有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；

用于鉴定犬小孢子菌(M.canis)的靶序列含有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

用于鉴定Microsporum incurvatum的靶序列含有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。