[发明专利]一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法

说明书

本发明提供了一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法，属于高分辨熔解曲线分析技术领域。本发明方法采用1对特异性引物，基于实时荧光PCR(Real‑time PCR)熔解曲线鉴别红色毛癣菌、趾间毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌、和Microsporum incurvatum。所述1对特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于临床诊断、环境监测、食品安全等方面对皮肤癣菌的鉴别，从而为皮肤癣菌的感染治疗、环境卫生和食品安全的监测提供确实可靠的依据。

技术领域

本发明涉及高分辨熔解曲线分析方法的应用，具体涉及一种利用高分辨熔解曲线鉴别五种皮肤癣菌的方法，所述的五种皮肤癣菌分别是红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum。

背景技术

浅部真菌病是指由致病真菌或条件致病真菌感染人皮肤，指(趾)甲或毛发等浅表组织引起的疾病，是皮肤科门诊中的常见病，多发病。据报道，该病在人群中的患病率可高达20％-25％，且发病率仍呈逐年上升趋势。而皮肤癣菌是浅部真菌感染中最常见的病原菌，是一类嗜角质的病原性真菌，寄生或腐生于这些部位的角蛋白组织中，引起体癣、股癣和手足癣等皮肤癣菌病，危害人体健康，影响其正常生活。因此，需要快速、准确的鉴定出皮肤癣菌的菌种，为临床精准用药提供依据。

皮肤癣菌一般被分为3个属：毛癣菌属，表皮癣菌属和小孢子菌属。传统的皮肤癣菌鉴定依赖于菌落形态、镜下特征(主要是大分生孢子的形态特征)，生理、生化等表型特征。但形态学鉴定耗时费力，且对工作人员操作技术要求较高。随着分子生物学的迅速发展，越来越多的分子诊断学技术应用于皮肤癣菌的快速诊断。几丁质是一种纤维状的多糖，构成包括皮肤癣菌在内的许多真菌的细胞壁。几丁质合成酶(CHS)基因在多种真菌(如白色念珠菌，构巢曲霉等)中得到表达，通过对比序列发现该基因区域具有高度保守性，适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育分析。因此，通过使用引物对扩增CHS基因后进行测序，在NCBI进行基本局部比对，可以进行菌株鉴定，但该方法难以对所有菌株进行准确鉴定，且存在无扩增现象。此外，常用的技术还有有聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)，即针对某一基因片段进行PCR扩增后，用合适的限制性内切酶对PCR产物进行酶切，根据酶切产物的长度多态性，从而进行菌种鉴定，但该方法的实验过程复杂，不利于推广；或者采用随机扩增多态性DNA分析(RAPD),虽然具有所需DNA量小、敏感性高、操作简便迅速、便于大规模使用及费用低等优点，但其重复性和特异性往往受反应条件的制约，反应条件的改变往往影响检测结果的准确性。

高分辨熔解曲线(High resolution melting,HRM)分析技术，其原理是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，DNA片段单个碱基的差异都会使熔解温度(以下简称Tm)发生变化，从而使DNA片段在升温解链过程中形成不同的熔解曲线，进而区分不同菌种。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，与其他遗传分型技术相比，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、成本低、快速、高通量检测等优点，且结果准确，实现了真正的闭管操作。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供一种基于RT-PCR熔解曲线分析的鉴别五种皮肤癣菌的方法，特别是一种利用高分辨熔解曲线分析技术鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum的方法。

本发明的另一目的在于提供一种适用于高分辨熔解曲线能同时鉴别红色毛癣菌(T.rubrum)，趾间毛癣菌(T.interdigitale)，絮状表皮癣菌(E.floccosum)，犬小孢子菌(M.canis)和Microsporum incurvatum的一个特异性引物对。