[发明专利]抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其构建方法

说明书

本发明提供一种抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其构建方法；所述构建方法包括人工抗原的合成、小鼠免疫、杂交瘤细胞的筛选及建株、单克隆抗体的制备纯化及效价测定。所述人工抗原的合成包括免疫抗原、检测抗原的合成，所述杂交瘤细胞的筛选及建株包括SP2/0细胞的收集、脾细胞的收集、细胞融合、融合板的检测等步骤。本发明的制备方法简单，免疫效果好；能获得稳定分泌抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为水环境中邻苯二甲酸二乙酯的免疫学快速检测方法的建立提供研究基础。

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体地，涉及一种抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆 抗体杂交瘤细胞株及其构建方法。

背景技术

邻苯二甲酸二乙酯化合物属于邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)，是一种环境内分泌干扰物，常用于工业生产橡胶、树脂、或者在塑料中作为增塑剂，PAEs作为增塑剂与塑 料基质之间形成非共价键的氢键和范德华力，由于这两种作用力强度较弱，因此当塑料 制品被废弃到环境中时，PAEs将不断从塑料制品转移到环境介质中，最终通过食物链食 物网富集到高级生物体内，有研究表明PAEs会对生物体的器官、生殖系统和血液系统 造成较大的损害。

对环境中邻苯二甲酸二乙酯等PAEs小分子污染物的检测方法报道较多的有质谱法 (MS)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱(HPLC)、GC-MS、HPLC-MS、超声萃等方法。 这些常规的检测方法虽然能够完成对PAEs的定性或定量检测，且能达到较低的检测下 限，但存在一定的弊端，对实验设备要求高，现场实现难度较大，样品前处理程序繁琐， 耗费时间长。酶联免疫吸附实验克服了上述操作的缺点，利用ELISA方法构建的胶体金 免疫试纸条对样品的检测具有快速简便，灵敏度高，可以现场实时检测而且大规模生产 后胶体金试纸条的费用低廉，可重复性强。因此选择ELISA方法对环境中的PAEs进行 定性定量检测是目前为止相对快速和高效的选择。

然而，目前利用ELISA方法对PAEs进行检测，尚未见有公开报道的特异性针对邻苯二甲酸二乙酯的检测方法的建立，已有的研究所制备的单克隆抗体并非特异性针对邻苯二甲酸二乙酯的抗体，存在不能特异性识别邻苯二甲酸二乙酯的缺点。

文献《邻苯二甲酸二甲酯人工抗原包被的酶联免疫分析法的建立》中提到了其制备 邻苯二甲酸二甲酯单克隆抗体用于酶联免疫分析方法的建立，但该文献采用叠氮法，且获得的偶联比效果一般。

发明内容

针对现有检测技术的不足，本发明的目的是提供一种抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗 体杂交瘤细胞株及其构建方法。本发明提供一种构建高效稳定的抗邻苯二甲酸二乙酯单 克隆抗体杂交瘤细胞株的方法；为邻苯二甲酸二乙酯的ELISA检测方法建立及胶体金免疫层析(GICA)试纸条的研制提供了稳定高效的单克隆抗体源，为水环境中的邻苯 二甲酸二乙酯进行免疫学快速检测的实际应用提供研究基础。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供一种分泌抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 所述杂交瘤细胞株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17402。

第二方面，本发明提供一种所述的抗邻苯二甲酸二乙酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株 的构建方法，包括如下步骤：

S1、以邻苯二甲酸单乙酯为半抗原偶联物，利用混合酸酐法偶联制备邻苯二甲酸单 乙酯-BSA免疫抗原，利用碳二亚胺法制备邻苯二甲酸单乙酯-OVA包被抗原；

S2、采用所述邻苯二甲酸单乙酯-BSA免疫抗原对小鼠进行皮下免疫，收集血清样品； 采用所述邻苯二甲酸单乙酯-OVA作为ELISA检测的包被抗原，对获得的血清样品进行ELISA免疫血清效价检测，筛选出血清效价较高的免疫小鼠；