[发明专利]可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，所述4个SNP位点具体为ADH2基因的突变位点rs1229984，ALDH2基因的突变位点rs671，GABRA2基因的突变位点rs279858及rs279826；包括以下步骤：(1)根据4个SNP位点的上下游序列分别设计上游引物、下游引物；(2)配置多重PCR反应体系；(3)PCR扩增。本发明方法将PCR反应体系由4个体系/程序缩减至1个体系/程序，减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量，可大幅度降低检测成本。可以同时检测4个位点，通过一次反应可以对4个位点进行SNP分型。可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法。

背景技术

1、酒精代谢及相关基因

酒精中的主要成份为乙醇(CH₃CH₂OH)，饮酒后，乙醇在人体内的代谢主要依赖于乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶两种酶的催化。大部分乙醇通过乙醇脱氢酶作用生成乙醛，再通过乙醛脱氢酶作用生成乙酸，然后进入氧化循环反应，最终代谢成二氧化碳和水排出体外。

乙醇脱氢酶由ADH2基因编码，该基因位于4号染色体上，在3号外显子的第143号碱基处具有多态性位点。该位点GG型编码精氨酸，AA型编码组氨酸。研究显示，GG型表达产物乙醇脱氢酶活性较低，GA/AA型表达产物具有正常的乙醇脱氢酶活性，AA编码的乙醇脱氢酶酶活性最高可以达到GG型的40倍，见表1。GG型联合饮酒者和吸烟者因素能够显著增加上消化呼吸道肿瘤的风险。在中国人群中，ADH1B*1等位基因能增加食管癌患病风险，且饮酒可以增加这一风险。AG/GG基因型者罹患头颈癌的风险较携带AA基因型者增加34％，说明该基因的多态性与中国汉族人群头颈癌的易感性有关。

乙醛脱氢酶2(ALDH2)也是酒精代谢过程中关键酶之一，位于第12外显子的Glu504Lys多态性位点(又称rs671)，该位点发生碱基置换，即鸟嘌呤(G，野生型)被腺嘌呤(A，突变型)替代，导致该酶第504位氨基酸发生改变，即谷氨酸(glutamic acid，Glu)到赖氨酸(lysine，Lys)的替换。在人群中ALDH2基因型有3种情况，野生纯合型(GG型又称ALDH2*1/*1)，产生具有正常催化活性的酶；突变杂合型(GA型又称ALDH2*1/*2)，产生的酶催化活性下降，仅为野生型酶活性的10％-45％；突变纯合型(AA型又称ALDH2*2/*2)，产生的酶活性仅为正常的1％-5％，见表1。

2、酒精依赖及相关基因

GABA(γ-氨基丁酸)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质，约30％的中枢神经突触部位以GABA为递质。GABA的主要由两类受体调控，分别为GABAA和GABAB。在GABAA的编码基因GABRA2基因中，位于4号内含子的SNP位点(rs279826)和位于5号外显子的SNP位点(rs279858)与酒精引起的神经冲动密切相关。rs279858A和rs279826T的个体发生酒精依赖的风险低，而rs279858GG和rs279858CC基因型在嗜酒的人群中发现较多，与酒精依赖的病人的饮酒及酗酒的高风险相关，见表1。

表1酒精基因及其主要突变

3、普通PCR及多重PCR

聚合酶链式反应(PCR)已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。