[发明专利]一种香蕉枯萎病菌myosin-1基因敲除突变体的构建方法有效
| 申请号： | 201910303205.X | 申请日： | 2019-04-16 |
| 公开（公告）号： | CN110004184B | 公开（公告）日： | 2020-03-06 |
| 发明（设计）人： | 彭军;曾凡云;张欣;漆艳香;谢培兰;谢艺贤 | 申请（专利权）人： | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N15/10;C12N15/31 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 陈欢 |
| 地址： | 571101 *** | 国省代码： | 海南;46 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 香蕉 枯萎 病菌 myosin 基因 突变体 构建 方法 | ||
1.一种香蕉枯萎病菌myosin-1基因敲除突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)myosin-1基因敲除重组片段扩增
以野生型菌株Foc4基因组DNA为模板，引物FOC4MYOS-LBCK和FOC4MYOS-HPH-LB-R扩增myosin-1基因上游片段，引物FOC4MYOS-RBCK和FOC4MYOS-HPH-RB-F扩增myosin-1基因下游片段；引物HYG-F和HYG-R扩增潮霉素基因片段；
用引物FOC4MYOS-LB-F和HYG-R1来扩增上游重组片段，用引物HYG-F1和FOC4MYOS-RB-R来扩增下游重组片段；
2)分别取50μL的上下游重组片段，加入到300μL Foc4野生型菌株原生质体中，混匀，放置20min；缓慢滴加1.5～2mL PTC溶液，放置20min；然后转入到含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL潮霉素B的再生培养基中，混匀后，倒于培养皿中；于26～30℃培养3～7d后获得转化子，进行鉴定；
所述引物FOC4MYOS-LBCK、FOC4MYOS-HPH-LB-R、
FOC4MYOS-RBCK、FOC4MYOS-HPH-RB-F、HYG-F、HYG-R、FOC4MYOS-LB-F、HYG-R1、HYG-F1和FOC4MYOS-RB-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10所示。
2.根据权利要求1所述的香蕉枯萎病菌myosin-1基因敲除突变体的构建方法，其特征在于，鉴定方法为：
以转化子的基因组DNA为模板，设计四对引物用于鉴定myosin-1基因敲除突变体，四对引物分别是FOC4MYOS-LBCK和HPT-LBCK、HPT-RBCK和FOC4MYOS-RBCK、HYG-F和HYG-R、MYOS-CKFP和MYOS-CKRP；引物对MYOS-CKFP和MYOS-CKRP无扩增条带，而引物对FOC4MYOS-LBCK和HPT-LBCK、HPT-RBCK和FOC4MYOS-RBCK、HYG-F和HYG-R扩增出目的片段的转化子为阳性myosin-1基因敲除突变体；
HPT-LBCK、HPT-RBCK、MYOS-CKFP和MYOS-CKRP的核苷酸序列依序如SEQ ID NO:11至SEQID NO:14所示。
3.根据权利要求2所述的香蕉枯萎病菌myosin-1基因敲除突变体的构建方法，其特征在于，引物对FOC4 MYOS-LBCK和HPT-LBCK扩增出2.4kb的目的条带，引物对HPT-RBCK和FOC4MYOS-RBCK扩增出2.0kb的目的条带，引物对HYG-F/HYG-R扩增出1.4kb的目的条带。
4.根据权利要求1-3任一项所述的香蕉枯萎病菌myosin-1基因敲除突变体的构建方法，其特征在于，香蕉枯萎病菌myosin-1基因敲除突变体的基因组序列如SEQ ID NO:17所示。
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