[发明专利]一种香蕉枯萎病菌myosin-1基因敲除突变体的构建方法

说明书

本发明提供一种香蕉枯萎病菌myosin‑1基因敲除突变体的构建方法。使用Split‑marker基因敲除技术，采用PEG介导的方法进行原生质体转化，通过同源重组获得了Foc4myosin‑1基因敲除突变体。通过测定突变体菌株的生物学表型、致病力及对氰烯菌酯(JS399‑19)的敏感性，研究myosin‑1基因在Foc4的生长发育、致病力及对氰烯菌酯抗药性中的作用。结果表明，与Foc4野生型菌株相比，myosin‑1基因敲除突变体表现生长缓慢、产孢量减少、菌丝分支增多，对巴西蕉苗的致病力明显减弱，对氰烯菌酯的抗性显著增强。由此推测myosin‑1基因可能在Foc4的生长发育、产孢、致病力以及抗药性等方面发挥重要作用。

技术领域

本发明涉及一种香蕉枯萎病菌myosin-1基因敲除突变体的构建方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

香蕉枯萎病是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性土传病害，由尖孢镰刀菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4，Foc4)引起，病原菌腐生能力很强，在土壤中可长期存活，属于典型的潜伏性侵染。在实际生产中，防治香蕉枯萎病缺乏有效的方法。使用化学药剂、生物防治对香蕉枯萎病的防治效果并不理想，并且种植的抗病品种也易因病原菌的进化而逐渐丧失抗病性，明确香蕉枯萎病的致病分子机理才是解决问题的关键。人们对于香蕉枯萎病菌的致病分子机理还在不断探索中，近年来，对于香蕉枯萎病的致病机理与致病相关基因的研究已经在G蛋白、过氧化氢酶、转录因子和MAPK通路等方面取得了一定进展。但到目前为止其发病的具体机制仍不明确，这也在一定程度上阻碍了香蕉抗枯品种的选育。

氰基丙烯酸酯类杀菌剂氰烯菌酯(JS399-19)是一类新型杀菌剂，主要作用于病原菌的I型肌球蛋白。肌球蛋白(myosin)在真核生物中广泛存在，它的存在是基于Actin的马达蛋白家族，肌球蛋白能够沿着肌动蛋白微丝(microfilament)做定向运动，从而完成细胞内的各项生命活动(Hodge et al.，2000)。在丝状真菌中，肌球蛋白通过与细胞微丝骨架相互作用参与生物体多种重要的生物过程，包括细胞分裂、囊泡转运、维持细胞的形态和细胞的极性生长等细胞过程。真核生物中含有35类肌球蛋白，而在真菌中则只含有四类肌球蛋白。在亚洲镰孢菌中，总共有三种肌球蛋白，分别是I型的myosin 5，II型的Myo 2以及V型的myosin 2B。在禾谷镰刀菌中，肌球蛋白基因家族有三个成员，分别是一个未知蛋白、一个II型肌球蛋白(myosin-2B)和一个I型肌球蛋白(myosin I)。而在香蕉枯萎病菌中，很少有关肌球蛋白的研究及报道。

为了阐明香蕉枯萎病菌I型肌球蛋白myosin-1基因是否在抗药性及在病原菌致病过程中发挥作用，本发明利用Split-marker同源重组技术敲除香蕉枯萎病菌myosin-1基因，并对敲除突变体的生物学特性、致病力及对氰烯菌酯敏感性等生物学特性进行了分析，完善了该基因的具体功能，以期为香蕉枯萎病菌致病机理的研究及杀菌剂靶标的开发提供理论参考。

发明内容

本发明通过基因重组片段的构建及遗传转化，获得myosin-1基因敲除突变体。

本发明采取的技术方案如下：

一种香蕉枯萎病菌myosin-1基因敲除突变体的构建方法，包括以下步骤：

1)myosin-1基因敲除重组片段扩增

引物FOC4MYOS-LBCK和FOC4MYOS-HPH-LB-R扩增myosin-1基因上游片段，引物FOC4MYOS-RBCK和FOC4MYOS-HPH-RB-F扩增myosin-1基因下游片段；引物HYG-F和HYG-R扩增潮霉素基因片段；

用引物FOC4MYOS-LB-F和HYG-R1来扩增上游重组片段，用引物HYG-F1和FOC4MYOS-RB-R来扩增下游重组片段；

2)将原生质体与上下游重组片段混匀，进行遗传转化，获得转化子，进行鉴定；