[发明专利]一种Cas9-gRNA表达系统及其应用在审
| 申请号： | 201910305602.0 | 申请日： | 2019-04-16 |
| 公开（公告）号： | CN109913502A | 公开（公告）日： | 2019-06-21 |
| 发明（设计）人： | 潘讴东;杨佳丽;杨兴林;刘晓芬;夏清梅 | 申请（专利权）人： | 和元生物技术（上海）股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/113;C12N15/65;C12N15/90 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 陆惠中;王永伟 |
| 地址： | 200433 上海市浦东*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 表达系统 基因工程领域 核苷酸序列 打靶效率 发光能力 基因片段 载体相 折叠 荧光 构建 蛋白质 应用 发光 蛋白 转入 细胞 融合 | ||
1.一种split-sfYFP双载体，其特征在于，包括基因片段sfYFP10和sfYFP11，所述sfYFP10和sfYFP11的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的split-sfYFP双载体，其特征在于，所述基因片段sfYFP10和sfYFP11均与载体相连接。
3.根据权利要求2所述的split-sfYFP双载体，其特征在于，将sfYFP10和sfYFP11分别与saCas9蛋白表达载体和sgRNA携带载体连接。
4.根据权利要求3所述的split-sfYFP双载体，其特征在于，所述saCas9蛋白表达载体包括空载质粒pLenti-CMV-SaCas9-P2A-Puro-linker-EGFP-S11。
5.根据权利要求3所述的split-sfYFP双载体，其特征在于，所述sgRNA携带载体包括空载质粒pLenti-U6-sagRNA V2.0-CAG-EGFP-S10。
6.基于荧光分析的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-5中任意一项所述的split-sfYFP双载体。
7.一种Cas9-gRNA表达系统，其特征在于，包括权利要求1-5任意一项所述的split-sfYFP双载体。
8.根据权利要求1-5任意一项所述的split-sfYFP双载体、权利要求6所述的试剂盒或者权利要求7所述的Cas9-gRNA表达系统在判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用技术中的应用。
9.一种构建权利要求7所述的Cas9-gRNA表达系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：合成sfYFP10和sfYFP11；
S2：合成saCas9 gRNA的寡核苷酸链，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
S3：将saCas9蛋白表达载体单酶切后与S2得到的寡核苷酸链连接，进行回收纯化得到第一酶切产物；
S4：将sgRNA携带载体双酶切后进行回收纯化得到第二酶切产物；
S5：将S2中得到的第一酶切产物和sfYFP10连接得到第一载体，将S3中得到的第二酶切产物和sfYFP11连接得到第二载体，即得到含有split-sfYFP双载体的Cas9-gRNA表达系统。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在S3中，采用XbaI进行单酶切。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在S4中，采用SpeI和XbaI进行双酶切。
12.根据权利要求7所述的Cas9-gRNA表达系统在快速判断Cas9打靶效率中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
构建split-sfYFP双载体后将其共同转染细胞，显微镜下观察有荧光的细胞即为打靶成功的细胞。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述细胞为293T细胞。
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