[发明专利]一种Cas9-gRNA表达系统及其应用

说明书

本发明属于基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种Cas9‑gRNA表达系统及其应用。本发明公开了一种构建split‑sfYFP双载体的方法，包括将基因片段sfYFP10和sfYFP11与载体相连接，所述sfYFP10和sfYFP11的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明利用含有split‑sfYFP双载体的Cas9‑gRNA表达系统只能在共同转入同一个细胞的条件下才能完成超折叠并发光的特性，可以快速、准确的对打靶效率进行判断和评价。此外，本发明公开的sfYFP10和sfYFP11编码的蛋白质的发光能力和发光强度明显强于普通YFP蛋白，且具有融合后不易丢失荧光等优点。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说，本发明涉及一种Cas9-gRNA表达系统及其应用。

背景技术

双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术，是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该方法利用荧光蛋白及其突变体的特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，分别与不同目标蛋白连接。如果两个目标蛋白存在相互作用，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。在荧光显微镜下，根据荧光就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，有助于研究蛋白质相互作用。

GFP的一些定点突变能明显的改变其波长性质，由此产生的突变体，具有产生多色光的特性，如：66位的酪氨酸突变为色氨酸后成为青色荧光蛋白(cyan fluorescenceprotein，CFP)，203位的苏氨酸突变为酪氨酸后成为黄色荧光蛋白(yellow fluorescenceprotein，YFP)，145位酪氨酸突变为苯丙氨酸后成为蓝色荧光蛋白(blue fluorescenceprotein，BFP)。GFP、YFP、CFP和BFP都是由238个氨基酸组成的单体蛋白质，荧光的产生主要归功于分子内第65、66、67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸自环化形成生色团的功效，而该过程大约在蛋白质形成后约4h完成。Superfolder YFP蛋白，简称sfYFP蛋白，是荧光蛋白家族的重要成员。和其他荧光蛋白相比，superfolder YFP具有更强的折叠能力和红绿都发光的特性。

CRISPR/Cas9系统是目前用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具，具有快速、高效及特异性靶向等优势。携带CRISPR/Cas9系统的慢病毒不仅能够感染多种难感染的细胞，比如原代细胞，干细胞，神经元细胞等，而且能够将外源基因插入细胞基因组内，实现稳定转染。但是，Cas9基因的序列大约4kbp，接近慢病毒载体所容纳的包装量，这就导致在构建含有Cas9的慢病毒载体时很难再加入完整的荧光标记或抗性标记，为后续细胞的感染和突变克隆的筛选造成了一定的困难。

发明内容

为了解决现有技术中含有Cas9的慢病毒载体很难再加入完整的荧光标记或抗性标记的难题，本发明利用双分子荧光互补系统，将CRISPR/Cas9与慢病毒载体结合，构建双载体系统，一个载体包含Cas9和sfYFP10，另一个载体包含gRNA和sfYFP11，将其共同转染动物细胞，有荧光的细胞即为打靶成功的细胞，而荧光效率则可以反映打靶效率，而且由于sfYFP的红绿均发光的特性，有利于快速、准确的对打靶效率进行评价。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明一方面公开了一种split-sfYFP双载体，包括基因片段sfYFP10和sfYFP11，所述sfYFP10和sfYFP11的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。