[发明专利]实现通用酶催化功能多样性的突变体菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种由BtCrtI催化二步脱氢反应产生zeta－胡萝卜素的重组酿酒酵母突变体菌株，其特征在于，所述重组酿酒酵母突变体菌株的构建方法包括：

步骤A、构建BtCrtI基因的第453位组氨酸突变为精氨酸的重组质粒PRS416-BtCrtI⁴⁵³；

所述BtCrtI为Blakeslea trispora来源的CrtI；

将GAL7启动子、CYC1t终止子以及由酿酒酵母密码子进行优化并适当规避常用限制性酶切位点后合成的基因BtCrtI通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含XbaI和NotI酶切位点的线性片段GAL7启动子-BtCrtI-CYC1t终止子，即PGAL7-BtCrtI-TCYC1，所述PGAL7-BtCrtI-TCYC1的序列如SEQ ID NO. 2所示；之后，将该线性片段与PRS416质粒经XbaI和NotI内切酶处理后，使用T4连接酶连接，获得含有BtCrtI基因的PRS416质粒，即质粒PRS416-BtCrtI；

突变点的引入，在BtCrtI的453位设计引物，引入突变点使组氨酸H突变成了精氨酸R；以质粒PRS416-BtCrtI为模版，扩增片段GAL7-H453R、H453R-cyclt，将453位的两个片段通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含XbaI和NotI酶切位点的线性片段，将该线性片段与PRS416质粒经XbaI和NotI内切酶处理后，使用T4连接酶连接；所述的GAL7-H453R如SEQ IDNO. 9所示、所述的H453R-cyclt如SEQ ID NO. 10所示；

步骤B、将重组质粒转化酿酒酵母SyBE_Sc04020001中，筛选转化子，将筛得的转化子用YPD培养基培养获得重组酿酒酵母突变体菌株；所述SyBE_Sc04020001为高产GGPP的酿酒酵母菌株SyBE_Sc14C10采用L-arm－P_GAL1 －CrtB－Tpgk1－R-arm经同源重组在染色体组的特定位置上整合CrtB基因获得；

通过PCR扩增获得酵母启动子Ga11-10、基因CrtB、终止子Pgk1t、上游整合同源臂、下游整合同源臂，所用的基因CrtB按照酿酒酵母密码子进行优化并适当规避常用限制性酶切位点后由人工合成，应用重叠延伸PCR将酵母启动子Ga11-10、基因CrtB、终止子Pgk1t、上游整合同源臂、下游整合同源臂进行模块化组装，得到L-arm－P_GAL1 －CrtB－Tpgk1－R-arm，命名为Modulel，所述L-arm－P_GAL1 －CrtB－Tpgk1－R-arm的序列如SEQ ID NO. 1所示；

所述高产GGPP的酿酒酵母菌株SyBE_Sc14C10是在CEN.PK2-1C的基础上先Δgal1Δgal7Δgal 10::HIS3，然后Δyp1062w::KanMX获得。