[发明专利]实现通用酶催化功能多样性的突变体菌株及其构建方法

说明书

本发明属于微生物领域，公开了一种实现通用酶催化功能多样性的突变体菌株的构建方法，构建通用酶的突变体文库，通过摇瓶发酵筛选催化功能多样性的突变体菌株。本发明筛选获得了一种由BtCrtI催化二步脱氢反应产生zeta－胡萝卜素的重组酿酒酵母突变体菌株和一种催化四步脱氢产生的番茄红素与三步脱氢反应的链孢红素的比例为5:1的重组酿酒酵母突变体菌株。本发明利用重组酿酒酵母菌株，通过随机突变的性质得到了不同催化功能的BtCrtI的突变体菌株，明确了关键氨基酸位点，实现了脱氢步骤的可控性，丰富了CrtI的功能信息，并为重要天然产物的生物合成打下基础。

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及实现通用酶催化功能多样性的突变体菌株及其构建方法，尤其是涉及一种由BtCrtI催化二步脱氢反应产生zeta－胡萝卜素的重组酿酒酵母突变体菌株和一种催化四步脱氢产生的番茄红素与三步脱氢反应的链孢红素的比例为5:1的重组酿酒酵母突变体菌株及构建方法。

背景技术

在生物代谢过程中存在一类可以催化多步连续反应的通用酶。据统计在生物代谢酶中约有20％可以归为通用酶，在生物的生命代谢过程中发挥着重要的作用，尤其是它们催化多步反应的功能特性可以有效地精简生物体内的酶系统。在低等生物中通用酶表现出更高的比重，如大肠杆菌的代谢酶中，通用酶的比例达到了37％左右。在生物体系中包含着多种类型的通用酶，其中植物和藻类来源的八氢番茄红素脱氢酶PDS和ζ-胡萝卜素脱氢酶ZDS都可以催化2步连续脱氢反应，并且通过协同作用可催化八氢番茄红素发生4步连续脱氢反应。金黄色葡萄球菌来源的脱氢酶CrtN在金黄色色素的生物合成通路中催化C30的多烯类底物最多可发生4步连续脱氢反应。在虾青素的合成路径中，羟化酶CrtZ和酮化酶CrtW以β-胡萝卜素为底物发生2步连续羟化反应和2步连续羰基化反应。此外在水解酶和合成酶中也存在许多这类通用酶可以催化多步连续反应。

八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)是催化多步连续反应通用酶中的典型代表，也是番茄红素下游类胡萝卜素合成途径中的首要限速酶。CrtI可以催化八氢番茄红素发生多步连续脱氢反应依次生成链孢红素、番茄红素等不同碳碳双键饱和度的多种脱氢产物。在研究脱氢酶CrtI的催化反应时，发现不同生物源的CrtI在催化多步脱氢反应时，会展现出不同的主导反应步数，发生3步、4步甚至5步的脱氢反应。如Rrhodobacter来源的CrtI主要催化3步连续脱氢反应生成链孢红素，Erwinia来源的CrtI主要催化4步连续脱氢反应生成番茄红素，Neurospora来源的CrtI催化5步连续脱氢反应生成3,4-脱氢番茄红素。而对于特定生物来源的脱氢酶CrtI，其多步反应步数具有一定随机性，终产物组成中夹杂着不同脱氢步数的中间产物。

近年来，对于CrtI结构和功能多样性的研究并不多。2000年Dannert和Umeno等人通过点突变得到的欧文氏菌(P.ananatis)CrtI能够催化八氢番茄红素的四步脱氢反应转变为六步脱氢反应。2001年Wang和Liao研究团队利用酶定向进化策略，对三步脱氢球形红杆菌(Rrhodobacter sphaeroides)来源的CrtI进行突变，通过高通量筛选使得四步脱氢产物番茄红素的比例大幅提高。2010年Sandmann和Xiao的团队也获得了胶状红环菌(Rubrivivax gelatinosus)来源的CrtI突变体，使产物比例发生改变，由生产四步脱氢产物番茄红素转变为生产三步脱氢产物链孢红素。近年来，Schaub和Yu报道了欧文氏菌(Pantoea ananatis)来源CrtI脱辅酶的晶体结构(PDB：4DGK)，初步阐释了CrtI的基本结构信息，并推测了CrtI的反应机制。但该研究并没有结合酶的活性实验，缺乏结构与功能的相关性研究和验证，而事实上这对CrtI深入研究和探索是十分必要的。