[发明专利]一种检测牛结核病IFN-γ和牛副结核病抗体的试纸条及其制备方法

说明书

本发明提供一种检测牛结核病IFN‑γ和牛副结核病抗体的试纸条，包括样品垫、荧光微球标记垫、NC膜、吸水纸和PVC板；其中荧光微球标记垫上包被荧光微球标记的鼠抗牛IFN‑γ单克隆抗体和荧光微球标记的牛副结核蛋白；NC膜上设有检测线T1、T2和质控线C，检测线T1包被兔抗牛IFN‑γ多克隆抗体，检测线T2包被辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG，质控线包被表达纯化的IFN‑γ。本发明可以直接将采取的全血加入到已经稀释好的结核菌素中，反应后直接读数。本发明可以做到一卡同时检测两种疾病。同时本发明的生产成本低，可以快速，并定量检测，优势明显。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测牛结核病IFN-γ和牛副结核病抗体的试纸条及其制备方法。

背景技术

1942年Wissman经研究发现，某些β－二酮与铕配合后可吸收紫外光，发出强烈的铕离子的特征荧光；1979年，芬兰Soini和Hemmia提出“时间分辨荧光免疫分析”理论；1983年，Soini和Kojlla提出以镧系元素标记为示踪螯合物和时间分辨荧光测量相结合，建立一种新的非反射性微量分析技术；上世纪90年代，芬兰wallac以及加拿大Cisbio公司分别推出DELFIA和HTRF时间分辨免疫分析技术平台，取得商业成功；2003年，上海新波生物技术有限公司应用DELFIA技术平台推出了首个体外诊断产品，截止目前上市产品已达30余个。

TRFIA就是建立在荧光微球标记的基础上，配合荧光免疫分析仪，达到快速、定量、准确检测目的的一种检测方法。

目前检测牛结核的方法主要是ELISA检测全血中IFN-γ、血清中牛结核抗体和胶体金检测血清中的抗体。此两种方法均以检测血清中牛结核抗体为目的，ELISA还可以检测全血中牛IFN-γ，生产应用中比较普遍。

但是ELISA检测费时费力；胶体金检测快速，但灵敏度不高，误差大，相比荧光免疫层析低1～2个数量级，一般为定性或者半定量检测，准确度不够。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供本一种快速检测牛IFN-γ的方法，即时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA)，本试纸条可以同时检测牛副结核病抗体。

本发明通过以下技术方案实现：

一种检测牛结核病IFN-γ和牛副结核病抗体的试纸条，包括样品垫、荧光微球标记垫、NC膜、吸水纸和PVC板；其中荧光微球标记垫上包被荧光微球标记的鼠抗牛IFN-γ单克隆抗体和荧光微球标记的牛副结核蛋白；NC膜上设有检测线T1、T2和质控线C，检测线T1包被兔抗牛IFN-γ多克隆抗体，检测线T2包被辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG，质控线C包被表达纯化的IFN-γ。

优选地，所述检测线T1、T2、质控线之间的距离是分别5～8mm。

优选地，所述荧光微球的粒径为200～300nm。

本发明还提供了以上检测牛结核病IFN-γ和牛副结核病抗体的试纸条的制备方法，包括以下步骤：

S1:免疫荧光微球分别标记鼠抗牛IFN-γ单克隆抗体和牛副结核蛋白的制备

(1)将免疫荧光微球清洗并活化；

(2)免疫荧光微球分别与鼠抗牛IFN-γ单克隆抗体和牛副结核蛋白进行偶联；

(3)封闭免疫荧光微球上未结合表面基团；

(4)将偶联完成后的免疫荧光微球置于4℃保存。

S2:免疫层析试剂条的制备

(1)将样品垫、荧光微球标记垫分别用2％～5％的BSA浸泡，然后烘干；

(2)将荧光微球标记鼠抗牛IFN-γ单克隆抗体和荧光微球标记牛副结核蛋白按照1:1的质量比混匀，用喷膜机喷到所述标记垫上；