[发明专利]促进间质干细胞TSP4过表达的方法及其制剂和应用

权利要求书

1.一种通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取pCMV6-Thbs4质粒，根据所述pCMV6-Thbs4质粒的基因编码区序列设计TSP4的扩增引物，进行聚合酶链式反应扩增，得到寡核苷酸链；

获取pENTR11质粒载体，采用XhoI和BamHI对所述pENTR11质粒载体进行双酶切，得到带有黏性末端的pENTR11质粒载体；将所述带有黏性末端的pENTR11质粒载体与所述寡核苷酸链进行DNA连接反应，得到pENTR11-TSP4表达质粒；

获取Plv-Easy-T质粒，将所述Plv-Easy-T质粒与所述pENTR11-TSP4表达质粒连接处理，得到Plv-Easy-GFP-TSP4慢病毒表达质粒；

将所述Plv-Easy-GFP-TSP4慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞，得到Plv-Easy-GFP-TSP4慢病毒；

获取间质干细胞，采用所述Plv-Easy-GFP-TSP4慢病毒感染所述间质干细胞，得到TSP4过表达的间质干细胞。

2.如权利要求1所述的通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法，其特征在于，所述连接处理的步骤包括：

获取TE缓冲溶液和LR clonase II enzyme Mix培养基，按所述质粒Plv-Easy-T的用量为150～200ng/ul、所述pENTR11-TSP4表达质粒用量为50-150ng/反应物和所述TE缓冲溶液为8～10ul/ul·培养基的浓度，在所述LR clonase II enzyme Mix培养基中加入质粒Plv-Easy-T、pENTR11-TSP4和TE缓冲溶液，在温度为25℃～30℃的条件下反应12～24小时；

然后加入1～2ul/ul·培养基的蛋白酶K溶液，在温度为35℃～40℃的条件下，反应10～20分钟，得到Plv-Easy-GFP-TSP4慢病毒表达质粒。

3.如权利要求1所述的通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，且所述上游引物和所述下游引物的序列如下：

上游引物:5’CGGGATCCATGCCGGCCCCAC3’，

下游引物:5’CCGCTCGAGATTATCCAAGCGGTC3’。

4.如权利要求1所述的通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法，其特征在于，所述DNA连接反应的体系包括：

5.如权利要求1～4任一项所述的通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法，其特征在于，所述间质干细胞选自：骨髓间质干细胞、脐带间质干细胞、胎盘间质干细胞或脂肪间质干细胞。

6.如权利要求5所述的通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法，其特征在于，所述间质干细胞选自：第三代至第六代的间质干细胞。