[发明专利]促进间质干细胞TSP4过表达的方法及其制剂和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法，通过pCMV6‑Thbs4质粒和pENTR11质粒载体得到pENTR11‑TSP4表达质粒；然后将pENTR11‑TSP4表达质粒与Plv‑Easy‑T质粒连接得到Plv‑Easy‑GFP‑TSP4慢病毒表达质粒；再通过包装得到Plv‑Easy‑GFP‑TSP4慢病毒；最后利用Plv‑Easy‑GFP‑TSP4慢病毒感染间质干细胞，将病毒基因片段整合到间质干细胞的基因组中，得到TSP4过表达的间质干细胞，提高间质干细胞促血管生成活化效率，从而间质干细胞在缺血性疾病治疗药物中的应用，尤其是缺血性中风治疗药物中的应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法、一种慢病毒感染的间质干细胞制剂和应用。

背景技术

缺血性中风是指脑血栓形成或脑血栓的基础上导致脑梗塞、脑动脉堵塞而引起的偏瘫和意识障碍。血管生成对于缺血性中风患者的预后是非常重要的，中风后内源性神经干细胞是沿着血管生成这个“轨道”进入缺血损伤区进行神经再生修复的。血管生成被定义为从已存在的血管中生成新的血管，在组织生长和发展中，是一个正常的和至关重要的过程。重新建立功能性的脉管系统有利于促进中风的恢复，在中枢神经系统，血管生成的结果是使缺血半暗带血流恢复，促进缺血性中风的长期功能恢复。

间充质干细胞，是一种具有自我更新、高度增殖和多系分化能力的细胞群。随着干细胞治疗在相关领域的推进，多种干细胞系被用于脑缺血疾病的相关研究中，干细胞疗法已经成为缺血性卒中最有发展前景的治疗策略，应用干细胞移植为缺血性卒中缺血损伤组织修复和功能恢复提供了希望。目前，美国FDA批准的自体骨髓间充质干细胞(Bone marrowstromal cells,BMSCs)移植治疗缺血性脑卒中的Ⅰ、Ⅱ期临床试验己经完成，证明了自体BMSC经静脉途径移植治疗脑缺血的可行性。

但是，在实际应用中，由于间质干细胞在人体中的含量不高，例如：骨髓间质干细胞大约占据骨髓中单核细胞数量的0.001％至0.01％，在临床治疗中需要较大的采髓量，对患者年龄、身体条件、心理接受程度要求较高。且由于氧化应激、低氧等微环境改变使移植后间质干细胞的存活率非常低，新生血管形成速度慢等，极大地限制了干细胞在缺血性中风疾病中的治疗效果。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法，旨在解决因人体中现有间质干细胞数量极少，存活率低，新生血管形成速度慢，在缺血性疾病药物中应用治疗效果不佳等技术问题。

本发明实施例的另一目的在于提供一种慢病毒感染的间质干细胞制剂。

本发明实施例的又一目的在于提供一种慢病毒感染的间质干细胞的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种通过慢病毒感染促进间质干细胞TSP4过表达的方法，包括以下步骤：

获取pCMV6-Thbs4质粒，根据所述pCMV6-Thbs4质粒的基因编码区序列设计TSP4的扩增引物，进行聚合酶链式反应扩增，得到寡核苷酸链；

获取pENTR11质粒载体，采用XhoI和BamHI对所述pENTR11质粒载体进行双酶切，得到带有黏性末端的pENTR11质粒载体；将所述带有黏性末端的pENTR11质粒载体与所述寡核苷酸链进行DNA连接反应，得到pENTR11-TSP4表达质粒；

获取Plv-Easy-T质粒，将所述Plv-Easy-T质粒与所述pENTR11-TSP4表达质粒连接处理，得到Plv-Easy-GFP-TSP4慢病毒表达质粒；

将所述Plv-Easy-GFP-TSP4慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD.2G共转染293T细胞，得到Plv-Easy-GFP-TSP4慢病毒；