[发明专利]鼠种的分子鉴定方法

说明书

本发明公开了一种鼠种分子鉴定方法，该方法包括以下步骤：提取待测鼠种的基因组DNA；分别应用特异性引物扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因和线粒体细胞色素b基因，然后测序；将测定序列在NCBI网站上运行Blast核酸序列同源性检索，比对结果中同源性最高的序列为亲缘关系最近的鼠种。本发明中，PCR引物、反应程序通用性强，方法简单易操作，可以快速准确的进行鼠类鉴定，弥补形态学鉴定的缺陷，同时，采用CO I和cyt b两条基因序列进行相互验证提高了鉴定结果的准确性。除了在分类学上鉴定鼠种外，本发明的分子鉴定方法通过分析种属间的CO I和cyt b基因序列特征对于研究生物遗传多样性和系统进化有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种准确快速的鼠种分子鉴定方法。

背景技术

鼠的种属鉴定是鼠类研究的一项重要内容，目前大多都是以形态学特征为基础进行鉴定，如外形特征、头骨特征、牙齿特征等。

然而受栖息环境条件、生长发育阶段、器官形态等诸多因素的影响，同种鼠类的外观鉴别特征有时会出现变异而难以准确鉴定，典型的如白化褐家鼠(Rattus norvegicus)等。一些近缘种和隐存种在形态学特征上极为相似亦无法准确区分。样本的形态特征破损或残缺、材料腐败等因素也容易出现误判；而头骨特征和牙齿特征的鉴定极其繁琐耗时，需要丰富的专业分类知识和实践经验。由此可见，常规的形态学鉴定方法有一定的局限性，急需探索更为简便、准确的鼠类分类鉴定技术。

中国专利申请CN 105385699A公开了4种鼠类cyt B特异序列及分子鉴定方法，4种鼠类包括黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠和黑线姬鼠。然而，该发明仅限于鉴定待测样本是否为黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠和黑线姬鼠四种鼠，无法鉴定其他鼠种；并且，仅选用cyt b基因序列作为鉴定依据易出现错误。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于PCR的快速、简便、准确的鼠种分子鉴定方法，可克服常规形态学鉴定方法的局限性，且对鉴定人员的专业分类知识要求不高，用于形态相似或外形难以判别的鼠类的鉴定；此外，该方法还可发现更多的新种及隐存种，揭示更加丰富的生物多样性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种鼠种分子鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取待测鼠种的基因组DNA；

(2)分别应用特异性引物扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(CO I)基因和线粒体细胞色素b(cyt b)基因，然后测序；

(3)将测定序列在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上运行Blast核酸序列同源性检索，比对结果中同源性最高的序列为亲缘关系最近的鼠种，通常情况下，利用COⅠ单个基因的比对结果即可鉴定出未知鼠种，为确保结果的准确度和可靠性，同时利用cyt b基因的比对结果对上述结果进行验证；

步骤(1)中，鼠的肝脏、肌肉组织、脚趾或尾巴等均可用于提取基因组DNA；

步骤(2)中，用于扩增CO I基因的引物对的序列如下(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)：

正向引物CO I-F：5’-CCTACTCRGCCATTTTACCTATG-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物CO I-R：5’-ACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA-3’(SEQ ID NO.2)；

用于扩增cyt b基因的引物对的序列如下：

正向引物cyt b-F：5’--CAGCATTTAACTGTGACTAATGAC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物cyt b-R：5’--TACACCTAGGAGGTCTTTAATTG-3’(SEQ ID NO.4)；