[发明专利]一种用于生物样本中RNA的基因检测方法

权利要求书

1.一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，采用4步法进行RT-PCR检测方法，所述方法包括：

S1：设计与目标基因互补匹配的特异性寡核苷酸单链引物、一对特异性引物及探针；

S2：取待测样本，加入样本处理液后进行剧烈震荡1～2min，再加入0.5～2倍样本体积的水饱和酚，剧烈震荡1～2min，混合样本在50℃～70℃中保温5～20min；

S3：保温后的混合样≥12000rpm离心1～5min，取上清加入核酸吸附柱；

S4：≥12000rpm离心1～2min，弃流出液，加入300～800μl漂洗液漂洗，室温静置1～2min，≥12000rpm离心1～2min，弃流出液，漂洗1～2次；

S5：加洗脱液30～50μl，吸附柱在50～70℃下温浴3～10min；

S6：将吸附柱转移到新的1.5ml或2ml离心管中，12000rpm离心1～2min，收集流出液；

S7：步骤(6)离心管中加入5μl反应液A，42℃温浴10min；

S8：步骤(7)离心管中加入20μl反应液B，进行实时荧光定量PCR扩增分析或PCR产物进行电泳分析。

2.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述样本处理液中组分如下：1mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸，20mmol/L～100mmol/L NaCl，20mmol/L～100mmol/L KCl，0.1mmol/L～10mmol/L Tris-HCl，3mol/L～7mol/L GuHCl或3～6mol/L异硫氰酸胍，0.01％～1％Triton X-100，1μg/ml～0.1mg/ml蛋白酶K，0.1mg/ml～10mg/ml皂土。

3.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述漂洗液：100mmol/L～300mmol/L NaCl，1～5mmol/L KCl，1～20mmol/LNa2HPO4，1～5mmol/LKH2PO4，1mmol/L 2-巯基乙醇，0.1mg/ml～5mg/ml皂土，70～80％无水乙醇。

4.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述洗脱液组成如下:10mmol/L～50mmol/L PH8.0 Tris-HCl，10mmol/L～50mmol/L KCl，200mMNaCl，1～10mM MgCl2，10mM2-ME，0.4mM dNTP，10％甲酰胺，1～6％RNAsecure。

5.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述反应液A组分如下：50mmol/L PH8.0Tris-HCl，0.5μg OligodT或特异性寡核苷酸引物，2U/μl M-MuLV逆转录酶，1U/μl RNasin，50mM DTT，0.4mM dNTP，0.1‰NP-40，200mM NaCl，20％甘油。

6.根据权利要求1所述的一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，其特征在于：所述反应液B组分如下：50mM pH8.0 Tris-HCl，75mM KCl，25％甘油，0.2μM PCR上下游引物，0.5U/μl Taq DNA聚合酶，0.4mM dNTP，2％～10％甲酰胺，1×SYBR或0.2μM探针，0.01mMEDTA-Na2，1μg/ml BSA，0.05％Triton X-100。