[发明专利]一种用于生物样本中RNA的基因检测方法

说明书

本发明属于医疗技术领域，尤其为一种用于生物样本中RNA的基因检测方法，检测试剂盒中主要包括(1)样本处理液；(2)漂洗液；(3)洗脱液；(4)反应液A；(5)反应液B；本发明方法将生物体的组织或体液在样本处理液中进行剧烈震荡后在50℃～80℃范围内进行保温消化，消化后的悬浊液经酚氯仿进行分离，含有RNA的上清液经吸附柱进行分离，经过洗涤和洗脱后，将反应液A加入洗脱液进行37℃～50℃保温，保温后产物与反应液B混匀进行PCR扩增，PCR反应结果通过实时荧光定量PCR仪或数字PCR仪进行分析，本发明在解决传统RNA易降解的难题的同时将传统上对RNA样本处理到PCR分析的时间从大于8小时减少至3小时。

技术领域

本发明属于医疗技术领域，具体涉及一种用于生物样本中RNA的基因检测方法。

背景技术

RNA是遗传信息的载体，通常以单链线性形式存在，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达。mRNA一直是分子生物学的重要环节，现有的mRNA定量研究的方法有：Northernbolt、原位杂交、RT-PCR。目前Northern bolt 的方法定量较为准确，但要求样品含有较多RNA，对于一些难得的样本和低丰度的样品的mRNA检测上难以应用。RT-PCR是将目的mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，RT-PCR借助实时荧光定量PCR仪实现高灵敏、高特异定量检测mRNA。RT-PCR技术在医学领域一直得到广泛的应用，RT-PCR是以样本RNA为模板，利用随机引物或特异性引物在逆转录酶的作用下将RNA转录为cDNA，而合成的cDNA作为下一步PCR扩增的模板。

RT-PCR技术在最基因表达上应用比较成熟，但在样本的RNA提取和纯化上存在步骤繁琐、RNA易降解的难题，同时在PCR扩增时对样本量和纯度有着较大的要求，在医学检测时难以得到有效的推广。

发明内容

为了解决快速对生物组织及体液细胞的RNA检测问题，本发明提供了一种用于生物样本中RNA的基因检测方法。本发明目的是通过以下技术方案来实现对生物组织及体液细胞的RNA荧光定量检测：

样本处理：

组织样本处理：取一定量的组织样本(0.01g～0.5g)可在液氮或冰上碾磨器皿中进行碾磨破碎，碾磨时加入0.5～2ml的样本处理液。碾磨后的混合样转移至5ml、10ml或50ml的离心管中，加入0.5ml氯仿，等体积的水饱和酚，充分混匀后50℃～70℃消化5～20分钟。上下颠倒充分混匀，12000rpm离心3～5分钟；

生物体液样本处理：取含有靶基因的体液0.5～2ml，加入0.5ml样本处理液，漩涡震荡1～2分钟，加入0.3ml氯仿，1ml水饱和酚充分混匀后50℃～70℃消化5～20分钟。上下颠倒充分混匀，12000rpm离心3～5分钟。

核酸富集洗脱：

取上清液转移至核酸吸附柱，12000rpm离心1分钟，弃流出液，加入漂洗液0.6ml，室温静置0.5～1分钟，12000rpm离心30秒，弃流出液，吸附管空置离心30秒；

逆转录：

吸附柱转移至新的1.5ml离心管中，加洗脱液50μl，室温静置5分钟， 12000rpm离心1分钟，弃吸附柱，加入5μl反应液A，42℃温浴10分钟；

实时荧光定量PCR分析：

取逆转录后的反应液20μl加入PCR管中，加入10μl反应液后吹打混匀，PCR板微离心后进行实时荧光定量PCR扩增，PCR反应程序如下：94℃5 分钟；94℃15秒，65℃35秒(35个循环)；PCR反应程序中收集荧光信号在65℃时。

具体实施方式

具体实施案例：